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细胞转染
细胞转染的基本原理是将外源分子如DNA、RNA等导入真核细胞的技术。目前转染方法有多种,如脂质体转染法、磷酸钙- DNA共沉淀法、电穿孔转染法、腺病毒感染等。常规转染技术可分为两大类, 一类是瞬时转染,另一类是稳定转染,前者转染的外源DNA不整合到宿主染色体中,通常表达只持续几天,一般在转染24-72小时后检测。后者转染的外源DNA将整合到宿主染色体中,可持续性表达,一般可用于稳定细胞株的构建。
其中脂质体转染是常用的简便转染方法。脂质体(liposome)转染方法的原理在于,阳离子脂质体表面带正电荷,能与核酸的磷酸根通过静电作用将DNA分子包裹,形成DNA-脂复合体,被表面带负电荷的细胞膜吸附。再通过膜的融合或细胞的内吞作用,偶尔通过直接渗透作用,将DNA转运至细胞内,形成包涵体或进入溶酶体。当DNA从包涵体内释放后,进入细胞质,再进一步进入核内实现转录、表达。
实验流程:
siRNA/shRNA/miRNA/DNA转染细胞实验步骤(以6孔板为例)
1. 转染前一天接种细胞于6孔板,5×104每孔,第二天转染时细胞汇合度达到60%-70%每孔。
2. 转染前半小时将完全培养基换无血清培养基1.9 ml。
3. A液:RNA100pmol/DNA 2μg(根据核酸类型不同,用量不同)加入50 ul Opti-MEM无血清培养基,轻轻混匀,室温静置5min。
4. B液:脂质体使用前轻轻混匀,脂质体5ul 加入50 ul Opti-MEM无血清培养基,轻轻混匀,室温静置5min。
5. B液加入到A液中,用枪轻轻混匀,室温静止20min。
6. 将混合液均匀分散慢慢滴加到6孔板细胞中,边滴加边前后左右十字交叉轻轻摇晃。
7. 孵箱37℃培养4~6h,然后将无血清培养基换成完全培养基继续培养。
8. mRNA 水平的检测:在转染后24-48h后,用Real-time PCR的方法在mRNA水平进行检测。
9. 蛋白水平的检测:在转染后48-72h后,用Western-blot或免疫组化的方法在蛋白水平进行检测。