外泌体丨微小囊泡的逆袭之路：从 “细胞垃圾” 到诺奖级科研明星

外泌体（Exosomes）是一类由细胞主动分泌的纳米级（30-150nm）细胞外囊泡，其研究历程从被误认为“细胞垃圾”到成为生命科学与医学领域的“诺奖明星”，背后是对细胞间通讯机制的深度探索。本文将从以下几个维度系统梳理外泌体研究的关键内容：

从“细胞垃圾”到诺奖明星

Exosomes

1983年，科学家在绵羊网织红细胞中首次观察到一种被释放到细胞外的囊泡结构，最初认为其功能是细胞排出“多余垃圾”（如老化的转铁蛋白受体），因此未受重视。

直到2007年，瑞典科学家 Lötvall 团队证实外泌体可携带 mRNA 和 microRNA，且能将这些核酸传递给其他细胞并调控其功能，揭示了其作为 “细胞间通讯载体” 的核心价值。2013 年，诺贝尔生理学或医学奖授予了 “细胞囊泡运输调控机制” 的研究，进一步推动外泌体成为科研热点。

如今，外泌体因具有来源广泛（几乎所有细胞均可分泌）、天然靶向性、低免疫原性、可携带多种生物活性分子（核酸、蛋白、脂质等）等特点，在疾病诊断（液体活检）、药物递送、再生医学等领域展现出巨大潜力。

外泌体的分离

Exosomes

外泌体分离是后续研究的前提，但其低丰度、异质性（不同细胞来源的外泌体差异大）导致分离难度高，目前常用方法及特点如下：

① 超速离心法

原理

基于密度和沉降系数，通过高转速（100,000-120,000×g）离心分离。

优势

金标准，纯度较高。

不足

耗时（需 6-12 小时）、仪器依赖强、可能破坏外泌体结构。

② 密度梯度离心

原理

结合超速离心与蔗糖 / 碘克沙醇梯度，通过密度差异分离。

优势

纯度更高，可去除蛋白聚集体。

不足

操作复杂、产量低。

③ PEG 沉淀法

原理

聚乙二醇（PEG）破坏外泌体水化层，使其沉淀。

优势

操作简单、成本低、产量高。

不足

易混入蛋白、核酸杂质，纯度低。

④ 免疫亲和捕获

原理

利用外泌体标志物（如 CD63）的抗体特异性结合分离。

优势

特异性极高，可分选亚型。

不足

成本高、抗体可能影响外泌体活性。

⑤ 超滤法

原理

利用纳米级滤膜（如 100kDa）截留外泌体。

优势

快速、可规模化。

不足

可能因压力导致外泌体聚集。

外泌体的生成与鉴定

Exosomes

1、外泌体的生成机制

外泌体的生成是一个复杂的细胞内过程：

起始：细胞膜内陷形成早期内体（Early endosome）；
成熟：早期内体进一步分选、富集内容物，形成多泡体（Multivesicular body, MVB），MVB 内部通过膜内陷形成含纳米级囊泡的结构（即外泌体前体）；
释放：MVB 与细胞膜融合，将内部囊泡释放到细胞外，即为外泌体。

2、外泌体的鉴定

国际细胞外囊泡学会（ISEV）发布的MISEV2018指南强调，必须通过多种技术从三个层面对外泌体进行表征，单一方法不足以下结论。

粒径（NTA）分析

技术：纳米颗粒跟踪分析（Nanoparticle Tracking Analysis）

作用：测定样品中囊泡的粒径分布和颗粒浓度。外泌体的典型粒径范围是 30-150 nm。NTA结果应呈现一个主峰在该区间。

透射电镜（TEM）分析

技术：透射电子显微镜

作用：观察外泌体的形态。典型的外泌体在电镜下呈杯托状（Cup-shaped）或双凹圆盘状，这是制样过程中脱水造成的假象，但已成为其形态学标志。

免疫印迹（WB）分析

技术：蛋白质免疫印迹（Western Blot）

作用：检测外泌体特异性标志蛋白。

阳性标志物（普遍存在）：

跨膜蛋白：CD9, CD63, CD81, CD82
胞质蛋白：TSG101, Alix

阴性标志物（应不存在）：Calnexin（内质网标志）, GM130（高尔基体标志）, Cytochrome C（线粒体标志）等。用于排除细胞器污染。

一个完整的外泌体鉴定报告应至少包含：NTA粒径图（显示峰值在~100nm）、TEM电镜图（显示杯状形态）、WB结果图（显示CD9/CD63/CD81/TSG101阳性，Calnexin阴性）。

外泌体课题研究思路

Exosomes

设计一个外泌体相关课题，可以遵循以下通用思路：

Step 1

提出科学问题

表型驱动：在某种疾病或生理过程中，某种细胞分泌的外泌体是否发挥了作用？（例如：肝癌细胞来源的外泌体如何促进肿瘤转移？）

分子驱动：某个特定的分子（如miR-21）是否通过外泌体进行传递并行使功能？

Step 2

分离与鉴定

选择合适的方法从细胞上清或临床样本（血浆、尿液）中分离外泌体。

严格按照MISEV指南进行鉴定（NTA, TEM, WB），证明你拿到的是外泌体。

Step 3

功能机制研究-核心

功能获得/缺失实验：

功能获得（Gain-of-function）：将富集了外泌体的样品与受体细胞共培养，观察细胞表型（增殖、迁移、凋亡等）变化。
功能缺失（Loss-of-function）：用抑制剂（如GW4869）阻断母细胞的外泌体分泌，再收集条件培养基与受体细胞共培养，观察表型是否被抑制。

机制挖掘：

“货物”分析：对分离的外泌体进行多组学分析（蛋白质组学、转录组学、脂质组学），筛选出关键的功能分子（如特定的miRNA或蛋白）。
验证“货物”：在母细胞中过表达或敲低该关键分子，再看其分泌的外泌体功能是否发生变化。
下游通路：在受体细胞中，探究此外泌体“货物”分子调控了哪条信号通路（如PI3K/Akt, Wnt/β-catenin等）。

Step 4

应用与转化

诊断方面：分析临床样本中外泌体携带的特异性“货物”是否与疾病分期、预后相关，开发诊断模型。

治疗方面：

作为药物载体：工程化改造外泌体，装载化疗药物或核酸药物，靶向递送至病变部位。
作为治疗靶点：开发抑制 pathogenic 外泌体产生或摄取的策略。

外泌体研究课题案例

Tumor-derived exosomal miR-19b-3p facilitates M2 macrophage polarization and exosomal LINC00273 secretion to promote lung adenocarcinoma metastasis via Hippo pathway （IF=10.6）

分离鉴定：采用超速离心法从细胞条件培养基中分离外泌体，通过透射电镜（TEM）观察到典型囊泡形态，纳米颗粒跟踪分析（NTA）确认粒径约 100nm，Western blot 检测到外泌体特异性标志物 CD9、CD81，同时用外泌体抑制剂 GW4869 验证外泌体分泌依赖性。

功能实验：肺腺癌细胞（A549/H1975）外泌体可诱导 THP1 来源巨噬细胞向 M2 型极化（CD206⁺CD11b⁺细胞比例升高，M2 标志物 ARG1/CD206 等上调）；反之，M2 型巨噬细胞外泌体可促进肺腺癌细胞迁移、侵袭及活力，且该效应可被 GW4869 阻断。

机制探索：形成调控循环 —— 肺腺癌细胞外泌体 miR-19b-3p 靶向巨噬细胞 PTPRD，抑制其介导的 STAT3 去磷酸化，激活 STAT3 以诱导 M2 极化及 LINC00273 转录；M2 巨噬细胞外泌体将 LINC00273 递送至肺腺癌细胞，后者招募 E3 泛素连接酶 NEDD4 促进 LATS2 泛素化降解，失活 Hippo 通路并激活 YAP，YAP 进一步诱导 RBMX 转录，RBMX 结合 miR-19b-3p 促进其包装入肺腺癌细胞外泌体。

体内验证：构建尾静脉（肝肺转移）及股骨腔（骨转移）移植模型，沉默巨噬细胞 miR-19b-3p 或 LINC00273 后，肺腺癌小鼠的肝肺转移结节减少、骨转移程度减轻，证实该调控轴对转移的促进作用。

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