动物模型构建丨线栓法制备脑缺血大鼠模型

脑缺血（cerebral ischemia）是指脑部血流供应不足以维持正常代谢需求的一种病理状态，常导致不同程度的脑组织损伤，并与多种神经退行性疾病密切相关。临床上，脑缺血性疾病约占所有脑血管疾病的80%，具有高发病率、高致残率和高死亡率的特点，严重威胁人类健康。受限于临床研究的伦理与实际条件，建立可靠的动物模型对深入探索其发病机制及开发有效治疗方法具有重要意义。

目前常用于构建脑缺血模型的实验动物包括啮齿类（如大鼠、小鼠）、非人灵长类、兔及猪等。其中，大鼠因其脑血管解剖结构与高等动物接近、模型稳定性好、成本较低以及脑组织便于进行后续生化分析等优势，被广泛应用于脑缺血模型的制备。需注意的是，不同品系大鼠（如Wistar、F344、SD）在脑血管解剖和缺血敏感性方面存在差异，应在实验设计时予以考虑。

脑缺血动物模型总体上可分为两类：全脑缺血模型和局灶性脑缺血模型。根据血流是否恢复，又可进一步分为永久性闭塞模型和缺血再灌注模型。

全脑缺血模型：是指通过实验方法人为阻断动物脑部的全部血液供应，以模拟临床中心脏骤停、严重失血或全身性休克所导致的全局性脑缺血状态。目前，常用的造模方法主要包括以下三种：双血管闭塞/低压模型（2VO/低压模型）、三血管闭塞模型（3-VO模型）及四血管闭塞模型（4-VO模型）。

注：图片来源于网络

局灶性脑缺血模型：模拟人类常见的局部脑血流下降，研究更为广泛。制备方法包括栓塞法、线栓法及光化学法等，其中以大脑中动脉阻塞（Middle Cerebral Artery Occlusion, MCAO）模型最为常用。

MCAO模型通过阻塞大脑中动脉起始段，引起其供血区（主要是纹状体和部分大脑皮层）血流持续下降，其缺血程度和范围受阻塞时间、位置及侧支循环的影响。该模型因病理机制与人类缺血性脑卒中高度相似，被广泛用于发病机制研究和药物筛选。

线栓法是制备MCAO模型的经典方法，主要包括Longa法（尼龙线头端灼烧成球形）和Koizumi法（线头涂覆硅酮）。该技术无需开颅、损伤小、操作相对简便、缺血区域可控，并可实现再灌注，是理想的局灶性脑缺血模型，但其成功制备需依赖一定的显微外科经验。

注：图片来源于网络

以下以大鼠为例，详细介绍线栓法MCAO模型的制备步骤：

线栓法制备脑缺血动物模型

操作步骤

Step 1

动物准备

多选用雄性SD大鼠，体重建议250–300 g（体重与血管粗细相关，需保持一致）。
雄性动物可避免雌激素波动对缺血结局及行为评估的干扰。

Step 2

麻醉与备皮

大鼠腹腔注射麻醉后仰卧位固定，颈部备皮消毒，术中注意保温。适度拉伸颈部以便于血管分离。

Step 3

血管暴露

颈正中切口，钝性分离腺体与筋膜，清晰分离出颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA）。

Step 4

血管处理

分离ICA及其颅外分支翼颚动脉，利用缝合线打活结，结扎翼颚动脉，或者直接利用血管夹夹闭翼鄂动脉，避免线栓插入翼鄂动脉，保持CCA的唯一开放分支为ICA。

Step 5

夹闭颈总动脉和颈内动脉

使用微动脉夹夹闭颈总动脉和颈内动脉。

Step 6

插入线栓

在颈外动脉的残留段上剪开一个小口；

将提前准备好的栓线插入直至大脑中动脉的起始处，线栓插入17-18mm。

Step 7

缝合与恢复

结扎ECA残端，消毒并缝合伤口。待动物苏醒后观察神经症状，出现偏瘫、转圈等行为视为造模成功。

Step 8

再灌注操作

如需恢复血流，将线栓退至ECA起始处即可。

Step 9

取材及检测

安乐死与取脑：到达预定观察时间点（如再灌注后24h）后，采用过量麻醉或断头法安乐死动物。迅速取出完整脑组织，置于冰盐水或预冷的PBS中短暂清洗，以去除表面血液。

脑组织处理：

用于TTC染色：将洗净的脑组织置于-20℃冰箱中快速冷冻10-15分钟，待其稍变硬后，于冠状面均匀切成1-2 mm厚度的脑片。

正常脑TTC染色

脑缺血TTC染色

用于病理切片（石蜡/冰冻）：将完整脑组织直接投入4%多聚甲醛溶液中固定24-48小时，之后再进行脱水、包埋等步骤。或直接使用OCT包埋剂进行冰冻包埋。

MCAO正常-HE

MCAO损伤-HE

用于分子生物学检测：根据需要，可快速分离缺血侧与对侧大脑半球或特定脑区，立即投入液氮中速冻，随后转移至-80℃超低温冰箱中长期保存。

CON-TUNEL

MCAO-TUNEL

假手术组

仅分离血管，不插入线栓，其余步骤相同。

注意事项

栓线选择：线栓直径需与动物体重匹配，头端应光滑以降低血管损伤风险。

线栓硬度：过硬易刺破血管或妨碍再灌注，应选择硬度适中的线栓。

插入深度：常见推荐深度为18.5 ± 0.5 mm（以270 g大鼠为参考），实际操作中应以手感遇到阻力为准，避免盲目推进。

动物品系：不同品系大鼠对缺血敏感性存在差异（如F342 > SD > Wistar），预实验阶段需加以验证。

血糖控制：高或低血糖均会加重脑损伤，建议术前禁食12–24 h，术中或术后监测血糖。

血流监测：如有条件，应采用激光多普勒等技术实时监测脑血流，确保阻塞有效性（血流下降超过70%）。

线栓法制备脑缺血动物模型

模型评价

神经行为学评分（缺血24小时后进行）

Longa评分

0分：无神经缺陷；

1分：不能完全伸展对侧前爪；

2分：行走时向瘫痪侧转圈；

3分：向瘫痪侧倾倒；

4分：不能行走，意识丧失。

评分≥1分表示模型成功。

Bederson评分（提尾观察）

0分：无异常；

1分：对侧前肢屈曲回收；
2分：侧推阻力下降；
3分：自发旋转。

通常认为1–3分且48小时内存活为造模成功，研究中多采用2–3分动物。

TTC染色

取脑冠状切片，2 mm厚度，1% TTC溶液37℃避光孵育30分钟。正常组织呈玫瑰红色，梗死区域为白色。

组织病理学观察

模型组应出现神经细胞大量消失、核固缩、尼氏体溶解及胶质细胞增生等典型缺血改变，假手术组细胞结构正常。

线栓法制备脑缺血动物模型

研究意义与未来应用

线栓法MCAO模型不仅成功模拟了人类缺血性脑卒中的病理生理过程，包括能量代谢障碍、兴奋性氨基酸毒性、氧化应激、炎症反应及细胞凋亡等一系列级联反应，更为深入解析脑缺血损伤的内在机制提供了理想的在体研究平台。

该模型的应用极大地推动了卒中研究的发展：

在基础研究层面，它被用于筛选和验证众多神经保护剂、抗炎药物及溶栓药物，为新药研发提供了关键的临床前数据；
在机制探索层面，科学家们利用该模型揭示了众多信号通路在脑缺血损伤与修复中的作用；
在转化医学层面，结合先进的影像学、分子生物学技术，该模型有助于发现新型生物标志物，并评估干细胞治疗、神经调控等新兴治疗策略的安全性与有效性。

随着技术的不断创新，线栓法MCAO模型将继续在精准医疗领域发挥重要作用。例如，通过与转基因动物结合，研究特定基因在卒中后的功能；通过优化线栓材料和设计（如可触发溶栓的智能线栓），实现更精准的时空控制；在康复医学研究中，该模型也是评估各种神经功能康复训练方法效果的核心模型。

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线栓法MCAO模型的成功制备高度依赖于熟练的显微外科操作技巧、对解剖结构的深刻理解以及严格的质控标准。操作的细微偏差都可能直接影响缺血区域的稳定性、可重复性以及实验结果的可靠性，这为许多研究团队带来了技术门槛高、培训周期长、结果波动大等挑战。

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