稳转细胞系：从构建到应用的全面解析

在生物医药研发、基础科学研究以及工业生产中，稳转细胞系作为一种强大而可靠的工具，扮演着不可或缺的角色。它如同一座稳定生产特定蛋白质或执行特定功能的“活体工厂”，极大地推动了生命科学领域的进步。

随着生物药市场蓬勃发展，稳转细胞系技术正依托CRISPR与转座子等精准整合工具，向自动化、高通量的新纪元迈进。其应用前景早已突破蛋白生产的传统边界，正作为关键基石，支撑着从药物筛选、疾病建模到下一代细胞/基因治疗的全链条创新。

01

构建方法/ 稳转细胞系

 

稳转细胞系的构建核心在于将外源基因稳定地整合到宿主细胞的基因组中，使其能够随着细胞的分裂而遗传给子代细胞。

主要方法有以下几种：

化学转染法/ 稳转细胞系

 

原理：利用阳离子聚合物（如PEI）或脂质体（如Lipofectamine）与带负电的DNA形成复合物，通过细胞的内存作用将DNA导入细胞。

优点：

  • 操作相对简单，成本较低。

  • 适用于多种类型的细胞，尤其是贴壁细胞。

  • 可转染大片段DNA。

缺点：

  • 转染效率因细胞类型而异，对某些难转染细胞（如原代细胞、悬浮细胞）效率较低。

  • 整合多为随机多位点整合，表达水平和稳定性差异大。

  • 细胞毒性相对较高。

 
 

详细构建步骤

  1. 质粒准备：制备含有目的基因和筛选标记基因（如抗新霉素/NeoR、抗嘌呤霉素/PuroR）的高纯度、无菌质粒。

  2. 细胞铺板：在转染前约24小时，用胰蛋白酶消化处于对数生长期的细胞，以适当的密度（通常为60%-80%汇合度）重铺于细胞培养板/皿中，以确保转染时细胞处于最佳生长状态。

  3. 转染复合物制备：

    将质粒DNA稀释于无血清培养基中。

    将转染试剂（如Lipofectamine 3000, PEI）轻轻混匀，并稀释于另一管无血清培养基中。

    将稀释后的DNA与稀释后的转染试剂轻轻混合，室温静置15-20分钟，形成DNA-转染试剂复合物。

  4. 转染：将复合物逐滴均匀加入细胞培养基中，轻轻摇晃培养皿混匀。

  5. 换液：转染后4-6小时或24小时（取决于试剂和细胞类型），更换为新鲜的完全培养基，以减轻毒性。

  6. 筛选：转染约48小时后，更换为含有相应筛选抗生素（如G418, Puromycin）的培养基。未成功转染的细胞会逐渐死亡，此过程通常持续1-2周。

  7. 单克隆化：待抗性细胞形成克隆后，使用克隆环、有限稀释法或通过自动化克隆挑取仪挑选单个克隆，转移至新的培养板中扩增。

  8. 鉴定与保种：通过qPCR、Western Blot、免疫荧光等方法鉴定目的基因的表达水平和稳定性，筛选出高表达的单克隆细胞株，并进行冻存。

 
 

注意事项

  • 细胞状态：确保细胞处于最佳生长状态，无支原体污染，是成功转染的前提。

  • 优化条件：质粒DNA的纯度、用量，以及DNA与转染试剂的比例需要针对不同细胞系进行优化，是实验成败的关键。

  • 抗生素筛选：需预先测定所用细胞系对特定抗生素的最低致死浓度，筛选浓度应略高于此浓度。抗生素需现用现配。

  • 随机整合：该方法为随机整合，可能导致基因沉默或表达水平低下，需要筛选大量单克隆以获得理想株系。

病毒转导法/ 常用慢病毒

 

原理：将外源基因克隆到慢病毒载体中，与包装质粒共转染包装细胞（如HEK293T）生产出有感染能力的病毒颗粒，再用病毒感染目标细胞。慢病毒能够整合到宿主基因组中。

优点：

  • 转导效率极高，对难转染细胞和原代细胞非常有效。

  • 可实现多位点整合，有助于获得高表达细胞株。

缺点：

  • 操作复杂，涉及病毒操作，需要在相应生物安全等级的实验室进行。

  • 存在插入突变和致癌风险，用于临床治疗时安全性要求极高。

  • 载体容量有限（通常<8kb）。

  • 成本较高。

 
 

详细构建步骤

  1. 病毒包装：

    将含有目的基因的慢病毒转移质粒、包装质粒（psPAX2等）和包膜质粒（pMD2.G等）共转染至包装细胞（通常是HEK293T细胞）中。

    转染后6-12小时换液。

    在转染后48小时和72小时，分别收集含有病毒颗粒的细胞上清液，离心过滤以去除细胞碎片，即可获得病毒原液。可进一步通过超速离心进行浓缩。

  2. 病毒滴度测定：通过qPCR法或荧光焦点法测定病毒原液的感染滴度（如TU/mL）。

  3. 细胞感染：

    将目标细胞以适当密度铺板。

    根据预实验确定的感染复数，将病毒液加入细胞培养基中，同时加入感染增强剂（如Polybrene， 5-8μg/mL）以提高感染效率。

    感染8-24小时后，更换为新鲜完全培养基。

  4. 筛选与单克隆化：感染约48-72小时后，开始加入筛选抗生素，后续步骤（单克隆挑取、鉴定、保种）与化学转染法相同。

 
 

注意事项

  • 生物安全：必须在相应生物安全级别（至少BSL-2）的实验室操作，所有接触病毒的废弃物需彻底消毒。

  • 预实验至关重要：必须通过预实验优化MOI值，以在保证高感染效率的同时，尽量减少多重感染和细胞毒性。

  • 时间窗口：病毒感染细胞的时间不宜过长，否则会对细胞造成较大毒性。

  • 插入突变风险：慢病毒为随机整合，存在插入致癌基因附近的风险，用于临床研究时需进行整合位点分析。

转座子系统/ 如PiggyBac

 

原理：将外源基因克隆到转座子载体中，与表达转座酶的辅助质粒共转染细胞。转座酶能识别转座子末端的反向重复序列，并将整个转座子序列“剪切-粘贴”到基因组中。

优点：

  • 整合效率高，操作比病毒系统简单、安全。

  • 承载容量大，可插入大片段DNA（>100kb）。

  • PiggyBac系统具有“无缝切除”能力，可将整合的片段完整移除，便于后续优化。

缺点：

  • 整合仍具有一定随机性。

  • 需要共转染两个质粒，优化条件可能需要时间。

 
 

详细构建步骤

以PiggyBac系统为例：

  1. 质粒准备：需要两个质粒：转座子质粒（含有目的基因、筛选标记，两侧为PiggyBac特有的末端重复序列ITR）和转座酶质粒（表达PiggyBac转座酶）。

  2. 共转染：将转座子质粒与转座酶质粒按一定比例（通常摩尔比为1：1到1：5，需优化）通过化学转染法共转染至目标细胞中。

  3. 筛选与单克隆化：转染48小时后，加入筛选抗生素。由于转座效率高，通常能在较短时间内看到大量抗性克隆。后续单克隆化与鉴定步骤同前。

  4. （可选）移除转座子：在不需要外源基因时，可再次瞬时转染转座酶质粒，即可将整合入基因组的转座子序列精确地“剪切”出去，实现“无缝”移除。

 
 

注意事项

  • 质粒比例优化：转座子与转座酶质粒的比例是影响整合效率和拷贝数的关键，需进行优化。

  • 高承载能力：特别适合大片段DNA（>10kb）的整合，是构建多基因或大型表达框的理想选择。

  • 整合偏好性：虽为随机整合，但PiggyBac倾向于整合到转录活跃区域的TTAA位点，有助于获得较高表达。

定点整合技术/ 如CRISPR/Cas9

 

原理：利用CRISPR/Cas9系统在基因组的特定位点（如“安全港”位点，如AAVS1）制造DNA双链断裂，同时提供含有同源臂的 donor DNA 模板，通过细胞的同源重组修复机制，将外源基因精确地插入到预定位置。

优点：

  • 整合位点精确可控，表达均一、稳定，排除了位置效应。

  • 安全性高，避免了随机整合可能带来的基因功能破坏。

  • 是当前基础研究和临床开发的金标准方向。

缺点：

  • 技术难度高，操作复杂，对实验人员技能要求高。

  • 同源重组效率在不同细胞系中差异较大，可能需要筛选。

  • 构建周期可能较长。

 
 

详细构建步骤

以CRISPR/Cas9介导的同源重组为例：

  1. 设计gRNA与Donor模板：

    设计针对基因组上“安全港”位点（如AAVS1）或特定位置的gRNA。

    构建同源重组Donor模板，其包含：两侧与切割位点同源的臂（~800bp）、目的基因、筛选标记。为提高效率，Donor模板通常为线性化双链DNA或腺相关病毒载体。

  2. 共递送：将Cas9/gRNA核糖核蛋白复合物 与 Donor DNA模板 通过电转或核转染的方式，共同导入目标细胞。此方法效率最高，且脱靶风险较低。

  3. 高浓度抗生素快速筛选：由于同源重组效率相对较低，通常使用较高浓度的抗生素进行快速、强力的筛选，以快速富集成功整合的细胞。

  4. 单克隆化与精密鉴定：挑选单克隆后，需进行严格的基因型鉴定。首先通过PCR初步筛选，然后必须通过Southern Blot或侧翼序列测序 确认外源基因是单拷贝、且精确整合到了目标位点，并排除随机整合的发生。

 
 

注意事项

  • 技术门槛高：涉及CRISPR设计、RNP复合物制备和高效率转染（如电转），操作复杂。

  • 鉴定要求严苛：不能仅凭表型（抗性）和普通PCR进行判断，必须采用Southern Blot或长片段测序等方法来确认为精准的定点整合。

  • 细胞类型限制：同源重组效率高度依赖于细胞类型，在某些细胞系（如CHO）中效率可能很低。

  • 黄金标准：尽管流程复杂，但所得细胞系表达均一、稳定，是用于生物药生产的黄金标准。

通过理解这些方法的详细步骤和核心注意事项，研究者可以根据实验目的、细胞类型和现有技术平台，选择最合适的策略来构建高质量的稳转细胞系。

附：系统比较表

02

优势/ 稳转细胞系

 

与瞬时转染相比，稳转细胞系具有无可比拟的优势：

  • 长期稳定的基因表达：外源基因整合入基因组，可长期、稳定地遗传和表达，无需反复转染。

  • 表达均一性：经过单克隆筛选后，细胞群体中所有细胞的基因型和表型高度一致，保证了实验结果的可靠性和可重复性。

  • 适用于大规模生产：为重组蛋白、抗体等生物制品的工业化生产提供了稳定、可持续的细胞来源。

  • 降低成本和提高效率：省去了反复转染的成本和时间，特别适合长期研究和工业化应用。

  • 是构建复杂疾病模型的基础：例如，通过稳定表达特定致癌基因或疾病相关蛋白，可以构建更贴近人类疾病的体外模型。

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应用领域/ 稳转细胞系

 

稳转细胞系作为现代生命科学的基石工具，其应用已渗透到从基础科研到产业化生产的各个环节。以下是其核心应用领域的详细介绍：

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生物制药与工业化生产 / 应用

这是稳转细胞系最成熟、经济价值最高的应用领域，堪称生物药的“制造引擎”。

大规模生产治疗性蛋白：

  • 单克隆抗体：利用CHO（中国仓鼠卵巢细胞）等稳转细胞系，大规模生产用于治疗癌症、自身免疫性疾病（如阿达木单抗、利妥昔单抗）的抗体药物。这是目前最主要的生产方式。

  • 重组蛋白/细胞因子：稳定生产胰岛素、人生长激素、干扰素、促红细胞生成素等，用于替代疗法和治疗各种疾病。

  • 酶制剂：生产用于酶替代疗法（如戈谢病）、溶栓（如组织纤溶酶原激活剂）或工业催化的酶。

疫苗生产：

构建稳定表达病毒抗原（如HPV病毒的L1蛋白，用于生产病毒样颗粒疫苗）或病毒受体的细胞系，用于安全、高效、可规模化的疫苗制备。

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药物发现与筛选 / 应用

在药物研发的早期阶段，稳转细胞系是进行高通量筛选和药理学研究的关键工具。

高通量药物筛选：

  • 报告基因系统：构建稳定表达荧光素酶、GFP或分泌型碱性磷酸酶等报告基因，且该报告基因受特定信号通路（如Wnt, NF-κB）或药物靶点（如GPCR, 核受体）调控的细胞系。通过检测报告基因活性，可快速从数百万化合物中筛选出先导化合物。

靶点验证与机制研究：

  • 通过稳定过表达、敲低或敲除特定疾病靶点基因，验证该靶点在疾病通路中的功能，并研究候选药物作用于该靶点后的下游效应。

药物安全性与毒性评价：

  • 构建稳定表达人类代谢酶（如CYP450酶）的细胞系，用于预测药物在体内的代谢情况和潜在的药物-药物相互作用。

  • 构建用于遗传毒性、肝毒性、心脏毒性评价的敏感细胞模型。

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基因功能与基础科学研究 / 应用

稳转细胞系为在细胞水平上精准操控和解析基因功能提供了可能。

基因功能增益与缺失研究：

  • 过表达：稳定引入外源基因，研究其过度表达对细胞表型（如增殖、凋亡、分化、迁移）的影响。

  • 基因敲减/敲除：利用稳定表达shRNA或CRISPR/Cas9系统的细胞系，长期、高效地沉默或敲除内源基因，从而研究其功能缺失效应。

信号通路解析：

  • 构建稳定表达通路关键节点（如激酶、转录因子）的野生型或突变型（持续激活/显性负性）蛋白的细胞系，用于精确绘制信号转导网络。

蛋白质相互作用与定位研究：

  • 构建稳定表达荧光蛋白标记的靶蛋白（如GFP-LC3用于自噬研究）的细胞系，用于实时、动态地观察蛋白质在活细胞内的定位、迁移和相互作用。

04

疾病模型构建 / 应用

通过引入疾病相关基因，稳转细胞系可以模拟人类疾病的特定病理特征，成为“培养皿中的疾病”。

肿瘤学研究：

  • 稳定表达致癌基因或敲除抑癌基因，构建体外肿瘤模型，用于研究肿瘤发生机制、侵袭转移和药物耐药性。

神经退行性疾病模型：

  • 构建稳定表达突变型β-淀粉样蛋白、Tau蛋白或α-突触核蛋白的神经元细胞系，用于研究阿尔茨海默病、帕金森病等的发病机制和药物筛选。

遗传病模型：

  • 通过引入致病突变，构建模拟囊性纤维化、亨廷顿病等遗传性疾病的细胞模型，用于病理研究和治疗策略探索。

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细胞与基因治疗 / 应用

稳转细胞系技术本身就是开发某些先进疗法的手段。

CAR-T/TCR-T细胞疗法：

  • 利用慢病毒载体转导T细胞，构建稳定表达嵌合抗原受体或T细胞受体的“活体药物”细胞，用于精准杀伤癌细胞。

干细胞治疗与组织工程：

  • 在干细胞中稳定表达特定的转录因子或生长因子，诱导其定向分化为所需的细胞类型（如多巴胺能神经元、心肌细胞），用于细胞替代治疗和组织构建。

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合成生物学 / 应用

在工程化改造生命体方面，稳转细胞系是理想的“底盘细胞”。

构建人工基因线路：

  • 将多个基因模块（如传感器、逻辑门、执行器）稳定整合到细胞基因组中，构建能够执行复杂功能（如感知环境并产生特定药物、进行生物计算）的工程化细胞。

 

 

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创建时间：2025-12-11 16:23