细胞培养常见问题及解决方案（50问）

培养基与试剂相关问题

如何选用细胞系培养基？

优先依据细胞来源公司提供的培养条件，其次参考ATCC推荐的对应培养基。避免随意更换培养基种类，以免导致细胞形态改变、死亡或功能丢失。

培养基颜色偏紫是什么原因？如何处理？

培养基开盖后CO₂溢出，pH偏碱导致颜色变紫。可旋松瓶盖放入CO₂培养箱中，待pH恢复即可。变紫的培养基仍可使用。

培养基颜色变黄、变浑是什么原因？如何处理？

变黄常因细胞密度过高、代谢产物积累；变浑多提示细菌污染。前者需及时传代，后者应丢弃污染细胞并彻底消毒。

无糖、低糖与高糖DMEM有何区别？

• 无糖DMEM：用于代谢研究或控制能量来源。

• 低糖DMEM（1 g/L葡萄糖）：适合代谢较慢的贴壁细胞。

• 高糖DMEM（4.5 g/L葡萄糖）：适用于生长快、粘附性低的细胞（如杂交瘤细胞）。

培养基中酚红的作用是什么？何时应使用无酚红培养基？

酚红作为pH指示剂（红=pH 7.2–7.4）。在雌激素敏感细胞（如乳腺细胞）培养、干细胞培养或流式检测前制备样本时，建议使用无酚红培养基。

碳酸氢钠在培养基中起什么作用？

作为pH缓冲剂，需与CO₂平衡使用。

高浓度碳酸氢钠（1.5–3.7 g/L）需5–10% CO₂；低浓度（0.35 g/L）可在普通培养箱中使用。

培养基是否需要添加抗生素？

常规不推荐添加，以免掩盖隐性污染。若为预防细菌污染，可短期使用青霉素-链霉素双抗，但注意其无法抑制真菌。

如何保存培养基以保持最佳性能？

避光冷藏（2–8℃），使用前恢复至室温或37℃预热。添加血清后，完全培养基应在2–8℃保存，并在2–4周内使用完毕。

为何储存在冰箱中的胎牛血清会出现沉淀？如何处理？

沉淀多为纤维蛋白聚集，常因解冻温度过高、剧烈摇晃或反复冻融引起。可经3000 rpm离心5分钟去除，不影响血清质量。

血清该如何正确解冻与保存？

建议2–8℃缓慢解冻过夜，轻柔混匀。解冻后分装冻存于-20℃，避免反复冻融。短期使用可保存于2–8℃，不超过1个月。

热灭活血清是否必要？

56℃加热30分钟可能破坏生长因子、增加沉淀，仅免疫学实验或特定细胞（如干细胞）培养时需要。

常规培养中，胎牛血清无需灭活（补体含量极低），而小牛/新生牛血清则通常需要灭活（补体活性高）。具体需依据实验与血清类型决定。

如何避免血清沉淀产生？

按推荐步骤逐步解冻（-20℃→4℃→室温），解冻时轻轻混匀，避免长时间置于37℃或反复冻融。

能否更换不同批次的血清？

尽量避免。不同批次血清存在组分差异，可能影响细胞生长。如需更换，建议先进行小规模测试。

DMSO的作用是什么？为何细胞冻存常用它？

DMSO是冷冻保护剂，可降低冰点、减少冰晶形成，提高细胞存活率。

常规冻存液配方为：

培养基:血清:DMSO = 7:2:1

DMSO是否具有抑菌性？

是的，DMSO本身可抑制多种细菌（如大肠杆菌、酵母菌）生长，浓度2%即有明显抑菌效果。

配好的冻存液可以保存多久？

4℃可保存1周，-20℃可保存1个月。建议现配现用，避免反复冻融。

有无商品化的无血清冻存液？

有。许多公司提供即用型无血清/无蛋白冻存液，适用于多种细胞，无需程序降温，使用方便。

L-谷氨酰胺在培养基中起什么作用？

作为细胞能量来源，参与蛋白质合成和核酸代谢。不稳定，易降解，长期培养需定期补充。

胰酶中为何添加EDTA？

EDTA可螯合Ca²⁺、Mg²⁺等二价离子，增强胰酶活性，促进细胞解离。胰酶应避免反复冻融。

如何判断细胞培养基是否仍可正常使用？

观察颜色（应为橙红色）、澄清度（无浑浊或沉淀），并进行无菌试验（空培）验证。

细胞污染与防控

细胞发生细菌污染如何处理？

培养基短期内变浑浊，镜下可见游动颗粒。轻度污染可用庆大霉素（50 µg/mL）处理，但建议丢弃污染细胞并彻底消毒环境。

真菌污染如何处理？

培养基表面可见霉斑，镜下可见菌丝或卵圆形孢子。真菌污染难以清除，应立即丢弃细胞，并对培养箱、超净台进行紫外消毒。

支原体污染有何特征？如何检测与处理？

特征：细胞生长缓慢、形态异常、背景干净但常有小黑点。

检测方法：PCR、Hoechst染色。

处理：可用支原体清除培养基（含抗生素），但珍贵细胞建议直接丢弃。

如何预防支原体污染？

定期检测（每1–3个月）、使用支原体预防添加剂、严格无菌操作、避免使用未经检测的共享试剂。

什么是“黑胶虫”污染？如何应对？

镜下可见布朗运动的小黑点，成分可能是细胞碎片、分泌物或血清沉淀。改善细胞状态、提高血清质量、增加换液频率可减少其出现。

病毒污染如何处理？

病毒污染难以清除，且存在生物安全风险。一旦发现，应按生物安全规程高压灭菌丢弃，并对设备进行彻底消毒。

交叉污染如何预防？

不同细胞系分开操作，使用专用试剂、耗材，避免同时操作多种细胞，定期进行细胞STR鉴定。

如何通过肉眼初步判断污染？

细菌：培养基浑浊、起雾。

真菌：漂浮霉斑、培养基清亮但沉淀增多。

支原体：培养基清亮但细胞状态差、生长慢。

无菌操作的关键要点有哪些？

工作前紫外消毒30分钟、试剂勿长时间暴露于空气、操作时避免手经过开放容器上方、定期清洁培养箱与水浴锅。

培养箱应如何维护以防污染？

定期清洁消毒（建议每月一次），更换无菌水盘，使用铜制内壁或添加硫酸铜抑制微生物生长。

细胞培养操作技巧

细胞何时换液最佳？

• 传代后隔天换液；

• 细胞密度高、培养基变黄时；

• 生长慢的细胞可减少换液频率，让细胞“静养”。

如何控制胰酶消化时间？

以细胞变圆、间隙增大、轻拍培养瓶可见细胞呈流沙状脱落为准。一般细胞需2–5分钟，敏感细胞（如原代细胞）时间更短。

细胞消化过度或不足有何表现？

过度：细胞碎片多、成片脱落、存活率低；

不足：细胞仍贴壁、吹打后成团。

细胞传代时离心速度应为多少？

推荐1000 rpm离心5–10分钟。转速过高易损伤细胞，过低则细胞沉淀不充分。

细胞为什么要“慢冻速融”？

慢冻（-1℃/分钟）可使细胞逐步脱水，减少冰晶损伤；速融（37℃水浴，1–2分钟内完成）避免重结晶损伤细胞膜。

细胞复苏后是否应立即去除DMSO？

一般复苏后加入完全培养基培养24小时再换液，避免DMSO毒性影响细胞贴壁。对DMSO敏感的细胞可复苏后立即离心更换培养基。

复苏后细胞完全不贴壁可能是什么原因？

• 细胞冻存前状态差；

• 冻存液不合格或冻存过程不当；

• 复苏操作过慢或解冻后未及时稀释。

复苏后细胞贴壁但第二天死亡的可能原因？

• 冻存前消化过度；

• 冻存液渗透压不适；

• 复苏后培养基不适应或细胞毒性积累。

细胞生长不均匀的可能原因？

• 传代后未混匀即放入培养箱；

• 培养瓶放置位置不平；

• 培养基液量不足或培养箱气流不均。

如何计数细胞活率？

台盼蓝染色法：死细胞染成蓝色，活细胞拒染。计数应在染色后10分钟内完成。也可使用自动细胞计数仪。

细胞类型与特性

原代培养、细胞系、细胞株有何区别？

• 原代培养：直接从组织分离的首次培养；

• 细胞系：原代培养首次传代后的细胞群体；

• 细胞株：通过克隆或筛选得到的具有特定特性的细胞亚群。

有限细胞系与连续细胞系有何不同？

• 有限细胞系：正常细胞，分裂次数有限；

• 连续细胞系：永生化细胞，可无限增殖（如HeLa、293T）。

何时使用5% CO₂？何时用10% CO₂？

取决于培养基中碳酸氢钠浓度：

• 1.5 g/L → 5% CO₂；

• 3.7 g/L → 10% CO₂。

使用Hank’s缓冲体系时无需CO₂培养箱。

上皮样细胞与成纤维样细胞如何区分？

• 上皮样：多边形、铺路石状排列、紧密贴壁；

• 成纤维样：长梭形、不规则排列、可重叠生长。

悬浮细胞与贴壁细胞培养有何不同？

• 悬浮细胞：无需消化，通过稀释传代；

• 贴壁细胞：需胰酶消化后传代。

细胞密度如何影响细胞形态与生长？

• 低密度：细胞伸展充分、形态典型，但生长慢；

• 高密度：细胞拥挤、形态可能改变，易发生接触抑制。

如何判断细胞是否处于对数生长期？

细胞分裂活跃、形态规则、透亮饱满、贴壁牢固，是进行实验或冻存的最佳时期。

细胞何时需要冻存？

• 处于对数生长期；

• 传代次数未超过推荐代数；

• 细胞状态良好、无污染。

冻存的细胞可在液氮中保存多久？

理论上可无限期保存。为稳妥起见，建议重要细胞每2–5年复苏一次后再重新冻存。

收到冻存细胞后应如何处理？

检查干冰剩余情况、冻存管是否完好。可选择立即复苏，或暂时存放于-80℃（24小时内）或液氮中长期保存。

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