从样本到数据：主流测序技术选择、实验技巧与数据分析全解析
进入21世纪第3个十年，高通量测序技术已从革命性的科研工具发展成为生命科学研究的核心基础设施。它像一台超高分辨率的“分子显微镜”，让研究者能够在碱基层面精准解读基因组奥秘，在单细胞维度解析组织异质性，在转录组水平捕捉基因表达的动态变化。从癌症精准医疗到罕见病诊断，从农作物育种到微生物生态研究，测序技术正在重塑人类对生命本质的认知边界，推动生物医学研究进入大数据驱动的精准时代。
随着测序成本的“超摩尔定律”下降和技术平台的多元化发展，Illumina、华大智造、Oxford Nanopore等平台的并行演进，为不同应用场景提供了丰富选择。然而，技术的快速发展也带来了新的挑战：
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如何根据具体研究问题选择最适合的技术方案？
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如何确保样本质量满足不同测序平台的严苛要求？
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如何理解不同技术的数据特征和分析逻辑？
这些问题的解答，正成为现代生命科学研究者的必备素养。
为帮助研究者系统掌握这一关键技术体系，本文将深入解析转录组测序、单细胞测序、全基因组测序等主流技术的核心原理与实验流程，并着重阐述每项技术的样本要求、质控标准和交付周期这些直接影响实验成败的关键环节。以下将从最广泛应用的转录组测序开始，逐步深入各技术细节：
RNA-seq
转录组测序通过对细胞内所有RNA分子进行高通量测序，将不稳定的RNA信号转化为稳定的cDNA进行测序分析，实现对基因表达的全景式数字化解析。作为连接基因组与表型的关键桥梁，它不仅揭示特定状态下所有基因的表达水平，还能发现新转录本、识别差异表达基因、解析可变剪接等调控机制，在疾病研究、药物开发、精准医疗和基础生物学等领域发挥着不可替代的核心作用。
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实验流程
样本采集 → RNA提取与纯化 → RNA质量评估 → 文库构建（mRNA富集/去除rRNA） → 测序上机 → 数据分析
样本要求
01
组织样本
新鲜组织：
采集后处理：立即放入液氮速冻，避免RNA降解
保存温度：-80℃长期保存，避免反复冻融
组织量：≥50mg（实体组织）
特殊组织：脑、肝、脾等RNA含量高的组织可适当减少用量
FFPE样本（福尔马林固定石蜡包埋）：
切片厚度：5-10μm，3-5张切片
保存时间：建议＜5年，时间越长RNA降解越严重
处理要求：需要特殊的RNA提取试剂盒
02
细胞样本
培养细胞：
细胞数量：≥1×10⁶个细胞
处理方式：离心收集后直接加入TRIzol或RNA保护剂
避免操作：反复冻融、长时间室温放置
原代细胞：
活率要求：＞80%
收集速度：尽快处理，减少外界刺激对基因表达的影响
03
血液样本
全血：
采血管：PAXgene Blood RNA Tube或Tempus Blood RNA Tube
采血量：2.5-5ml
保存条件：室温保存不超过3天，长期需-80℃
PBMCs（外周血单个核细胞）：
分离方法：Ficoll密度梯度离心
细胞数：≥2×10⁶个细胞
保存液：RNA保护剂或直接裂解
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RNA质量要求
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浓度与总量 |
纯度指标 |
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浓度：≥50ng/μl 总量：≥1μg（常规），≥500ng（微量建库） |
A260/A280：1.8-2.2（蛋白质污染指示） A260/A230：≥2.0（有机物污染指示） |
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完整性评估 |
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RIN值（RNA完整性数值）： 理想：RIN ≥ 8.0 可接受：RIN ≥ 7.0 FFPE样本：RIN ≥ 5.0 |
电泳检测： 真核生物：清晰的28S和18S rRNA条带，28S:18S ≈ 2:1 原核生物：23S和16S rRNA条带 |
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交付周期
标准周期：4-6周
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各阶段耗时 |
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样本接收与QC：1-2天 |
文库构建：3-5天 |
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测序：5-10天（取决于通量） |
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基础分析：3-5天 |
高级分析：5-10天 |
sc-seq
单细胞测序通过在单个细胞水平上解析基因组、转录组或表观基因组信息，以前所未有的精度揭示细胞间的异质性。其核心技术体系涵盖单细胞分离与捕获、高通量文库构建以及复杂的生物信息学分析。这场技术革命使得在单细胞分辨率下精确描绘组织细胞图谱、解析细胞发育分化轨迹、以及洞察细胞间通讯与微环境相互作用成为可能，极大深化了我们对生命过程复杂性的理解。
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平台类型 |
代表平台 |
通量 |
分辨率 |
建库原理 |
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微流控液滴 |
10x Genomics |
高（千-万级） |
3'/5'端 |
油包水液滴 |
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微孔阵列 |
BD Rhapsody |
中高 |
3'端 |
微孔捕获 |
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孔板法 |
Smart-seq2 |
低（96/384） |
全长 |
FACS分选 |
样本要求
01
细胞悬液制备
新鲜组织解离：
组织量：≥1cm³或100mg
解离酶选择：
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软组织：胶原酶IV（1-2mg/ml）
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硬组织：混合酶（胶原酶+透明质酸酶+DNase）
解离时间：30-60分钟，37℃
终止：含血清培养基或酶抑制剂
解离后处理：
过滤：40μm细胞筛过滤
红细胞去除：ACK裂解液（2-5分钟）
洗涤：PBS洗涤2-3次
02
细胞质量要求
活率标准：
理想：＞90%
可接受：＞70%
低于70%需考虑单核测序
细胞浓度：
10x Genomics：700-1200细胞/μl
BD Rhapsody：100-300细胞/μl
上样体积：根据平台要求
细胞状态评估：
台盼蓝染色：计数死细胞
AO/PI双染：更准确区分活/死细胞
显微镜检查：观察细胞形态和聚集情况
03
特殊样本处理
血液样本：
采血量：5-10ml外周血
PBMCs分离：Ficoll密度梯度离心
细胞数：≥5×10⁶个PBMCs
冷冻组织：
推荐方法：单核测序（snRNA-seq）
组织量：≥100mg
核提取：Dounce匀浆器+核提取缓冲液
FFPE样本：
可行性：有限，需要特殊处理
切片要求：5-10μm，5-10张
RNA质量：RIN可能较低
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质量控制要点
双细胞率：＜5%
细胞团块：＜10个细胞的团块
碎片比例：＜20%
线粒体基因比例：＜20%（预示细胞状态）
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交付周期
标准周期：8-12周
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影响因素 |
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样本复杂度 |
细胞捕获数量 |
数据分析深度 |
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各阶段耗时 |
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样本准备与优化：1-2周 |
单细胞捕获：1-2天 |
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文库构建：3-7天 |
测序：1-2周 |
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基础分析：2-3周 |
高级分析：3-4周 |
WGS
全基因组测序（WGS）通过高通量技术对生物体全部DNA进行无偏倚测序，以单碱基分辨率获取完整的遗传密码信息。它可全面检测单核苷酸变异、插入缺失、拷贝数变异和结构变异等所有类型基因组改变，不仅为遗传病诊断、肿瘤精准分型提供金标准，更是生命科学研究的基础工具，在物种进化、种群遗传、个性化医疗等领域具有不可替代的核心价值。
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实验流程
DNA提取 → 质量检测 → 文库构建 → 测序 → 变异检测 → 注释分析
样本要求
01
DNA样本类型
全血样本：
采血管：EDTA抗凝管（紫帽）
采血量：3-5ml
保存温度：4℃短期，-80℃长期
避免：肝素抗凝（影响PCR）
组织样本：
新鲜组织：≥25mg
保存方式：液氮速冻后-80℃
避免：福尔马林固定（DNA交联）
唾液样本：
采集管：Oragene DNA采集管
唾液量：2ml
保存：室温稳定
细胞样本：
细胞数：≥5×10⁶个
保存：细胞沉淀-80℃保存
02
DNA质量要求
浓度与总量：
常规WGS：≥1μg
高深度WGS：≥2μg
浓度：≥20ng/μl
纯度指标：
A260/A280：1.8-2.0
A260/A230：≥2.0
无RNA污染、蛋白质污染
完整性评估：
电泳检测：
-
琼脂糖凝胶：主带＞23kb，无明显降解
-
基因组完整性＞80%
片段分析仪：DV200＞50%
污染物检测：
PCR抑制剂：检测有无heme、EDTA等
微生物污染：16S检测
03
特殊要求
肿瘤样本：
肿瘤纯度：＞20%（体细胞突变检测）
配对样本：肿瘤组织+正常组织/血液
坏死率：＜30%
FFPE样本：
切片厚度：5-10μm
切片数量：5-10张
DNA质量：可能有片段化
微生物样本：
菌量：≥10⁸个细菌
纯度：无宿主DNA污染
测序深度建议
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应用场景 |
推荐深度 |
说明 |
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人类遗传病筛查 |
30-50× |
平衡成本与灵敏度 |
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肿瘤体细胞突变 |
100-150× |
提高低频突变检出 |
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新物种组装 |
50-100× |
结合长读长技术 |
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群体遗传学 |
10-30× |
大样本经济策略 |
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交付周期
标准周期：6-8周
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各阶段耗时 |
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DNA提取与QC：3-5天 |
文库构建：3-5天 |
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测序：2-3周 |
基础分析：2-3周 |
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高级注释：1-2周 |
临床解读：1-2周（如需要） |
Others
全外显子组测序
靶向测序
技术原理：
通过探针杂交捕获全基因组外显子区域进行测序。
样本要求：
DNA总量：≥1μg
质量要求：同WGS标准
特殊考虑：
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需要更高DNA完整性
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避免重复序列干扰
交付周期：4-6周
技术原理：
针对特定基因区域设计探针进行捕获测序。
样本要求：
DNA总量：10-100ng（根据panel大小）
适用样本：FFPE、微量DNA、ctDNA
质量要求：可适当放宽
交付周期：3-4周
甲基化测序
ATAC-seq
亚硫酸盐测序（WGBS）
样本要求：DNA≥1μg，避免降解
特殊处理：亚硫酸盐转化
交付周期：5-6周
甲基化芯片（850K）
样本要求：DNA≥250ng
交付周期：3-4周
技术原理：
利用Tn5转座酶检测开放染色质区域。
样本要求：
细胞数：50,000-100,000个活细胞
细胞类型：新鲜细胞或冻存细胞核
保存方式：立即处理或液氮保存
交付周期：4-5周
ChIP-seq
空间转录组
技术原理：
通过抗体富集特定蛋白结合的DNA片段。
样本要求：
细胞数：1×10⁶ - 1×10⁷个
交联处理：甲醛交联（转录因子）或免交联（组蛋白修饰）
对照样本：必须准备Input对照
交付周期：5-6周
技术原理：
在组织切片上原位捕获空间位置信息的转录组。
样本要求：
组织样本：新鲜冷冻OCT包埋
切片厚度：10-20μm
保存条件：-80℃避免反复冻融
质量检查：H&E染色确认形态
交付周期：8-10周
宏基因组测序
技术原理：
对环境样本总DNA直接测序分析微生物。
DNA要求：
总量：≥100ng
避免：宿主DNA污染、PCR抑制剂
交付周期：5-7周
样本类型：
肠道内容物：≥200mg，-80℃保存
土壤样本：≥1g，液氮速冻
水样：≥1L，滤膜富集
拭子样本：专用保存液
Guidelines
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采集前准备
伦理审批：涉及人类样本需获得伦理委员会批准
知情同意：获取受试者书面同意
采样工具：使用RNase/DNase free耗材
保存试剂：准备充足的保存液/管
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采集时机
动物组织：处死后立即取样
血液样本：相同采血时间点
避免：药物治疗后、应激状态下采样
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保存与运输
短期保存
RNA样本：RNAlater，4℃保存1周，-80℃长期
DNA样本：TE缓冲液，4℃保存数周
细胞样本：细胞冻存液，液氮或-80℃
长期保存
RNA/DNA：-80℃冰箱，避免反复冻融
组织样本：液氮保存最理想
备份保存：分装多份，不同地点保存
运输要求
干冰运输：-80℃样本
冰袋运输：4℃样本
常温运输：特殊保存液的样本
文件齐全：样本清单、知情同意书等
常见问题与解决方案
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问题 |
可能原因 |
解决方案 |
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RNA降解 |
取样慢、保存不当 |
快速处理、液氮速冻 |
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DNA片段化 |
样本陈旧、反复冻融 |
使用新鲜样本、避免冻融 |
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细胞活率低 |
解离过度、保存时间长 |
优化解离条件、尽快处理 |
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微生物污染 |
操作污染、保存不当 |
无菌操作、添加抗生素 |
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抑制剂存在 |
样本类型（血液、土壤） |
纯化步骤、稀释处理 |
Suggestions
基于研究目标的精准技术选型
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基因表达层面研究
群体基因表达谱分析 → 常规RNA-Seq
稀有细胞类型/细胞异质性研究 → 单细胞转录组测序
空间定位与组织微环境解析 → 空间转录组技术
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遗传变异检测
全面遗传筛查（罕见病/肿瘤全景） → 推荐全基因组测序
已知致病基因突变筛查 → 推荐靶向panel测序
成本效益平衡 → 全外显子组测序
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表观遗传学研究
染色质开放区域图谱 → ATAC-seq
特定蛋白-DNA相互作用 → ChIP-seq
全基因组DNA甲基化分析 → 全基因组甲基化测序
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微生物组研究
物种组成分析 → 16S/ITS扩增子测序
功能基因与代谢通路 → 宏基因组测序
活性功能基因表达 → 考虑宏转录组
Scientific Solution Selection
科学选型三步法：从研究目标到技术方案
明确研究层次 / Step 01
研究细胞类型明确且均质 → 常规RNA-Seq
研究细胞类型未知或异质 → scRNA-seq
需要空间定位信息 → 空间转录组
同时需要单细胞和空间信息 → scRNA-seq + 空间验证
确定变异类型 / Step 02
需要全面变异信息 → WGS
关注蛋白编码区域 → WES
已知基因区域筛查 → 靶向测序
结构变异检测 → WGS（长读长）
考虑样本特征 / Step 03
样本量充足、质量好 → 常规方案
样本量有限/珍贵 → 微量建库技术
样本质量差 → 考虑更稳健技术
临床样本 → 验证临床适用性技术
多组学 · 整合策略
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层级式技术组合
基础层：WGS/WES + RNA-Seq
调控层：RNA-Seq + ATAC-seq/ChIP-seq
功能层：转录组 + 蛋白组 + 代谢组
时空层：scRNA-seq + 空间转录组
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实施建议
分阶段验证：先基础层验证，再逐层深入
样本一致性：确保不同组学来自同一批样本
数据分析同步：建立整合分析流程
特殊研究 · 场景选择
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临床诊断应用
快速诊断：靶向panel测序
全面筛查：WES或临床级WGS
复发监测：ctDNA液体活检
伴随诊断：RNA-Seq表达分型
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发育生物学研究
时间序列：多时间点RNA-Seq
谱系追踪：scRNA-seq + 谱系标记
空间模式：空间转录组
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免疫学研究
免疫受体分析：scRNA-seq + V(D)J
免疫微环境：空间转录组 + scRNA-seq
免疫细胞功能：ATAC-seq + RNA-Seq
技术选择核对清单——必问问题
主要科学问题是什么？
样本可获得性和质量如何？
变异频率和类型预期？
空间和时间分辨率需求？
预算和时间限制？
后续验证计划？
数据分析能力和资源？
临床转化可能性？
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常见误区与建议（避免的错误）
过度追求新技术：忽略成熟技术的可靠性
样本量不足：导致统计效力不够
缺乏生物重复：无法区分生物学变异和技术变异
忽略样本质量：在低质量样本上使用高要求技术
技术不匹配：选择的技术无法回答核心问题
End
不同的测序技术各有特点和适用场景，选择时应综合考虑：
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科学问题的本质需求
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样本的可获得性和质量
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预算和时间的限制
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后续数据分析的能力
成功的测序实验始于良好的实验设计和严格的样本质量控制。无论选择哪种技术，规范的操作流程、完整的实验记录和专业的分析解读都是获得可靠结果的关键。
最好的技术不是最先进的，而是最适合的。在基因测序领域，合理的实验设计往往比技术本身更为重要。建议与代轩生物的技术顾问团队深入沟通，根据具体研究需求定制最合适的技术方案。
BiotechDX
代轩生物高通量测序解决方案
作为专业的高通量测序服务提供商，代轩生物始终以技术创新和数据质量为核心理念，致力于为客户提供专业可靠的多组学解决方案。
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在单细胞测序领域，我们不仅提供基于主流平台的高精度单细胞转录组分析，还提供前沿的单细胞微生物基因组测序服务，实现对复杂微生物群落中单个微生物菌株的精准解析。
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在多组学整合方面，我们构建了蛋白组学和代谢组学技术平台，为客户提供从基因到蛋白再到代谢产物的全方位研究视角。
公司建立了标准化的实验流程和严格的质量控制体系，配备经验丰富的技术团队和先进的生物信息分析平台，确保从实验设计、样本处理、文库构建到数据分析的每个环节都达到行业高标准。无论是基础研究项目还是临床转化应用，代轩生物都能提供定制化的完整解决方案，用精准数据助力科学发现。
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