明胶酶谱法检测MMP-2与MMP-9活性的实验方案及技术详解
明胶酶谱法（Gelatin Zymography）是一种基于聚丙烯酰胺凝胶电泳的酶活性检测技术，专门用于分析基质金属蛋白酶（MMPs）家族中明胶酶的活性，特别是MMP-2（明胶酶A，72 kDa）和MMP-9（明胶酶B，92 kDa）。其核心原理如下：
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底物包埋：将明胶（变性的胶原蛋白）作为底物共聚合在聚丙烯酰胺凝胶中
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电泳分离：在非还原条件下进行SDS-PAGE，使蛋白质按分子量大小分离，同时SDS使酶原（pro-MMP）和活性形式均变性
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酶复性：通过洗涤去除SDS，使酶在含有Ca²⁺、Zn²⁺等必需辅因子的缓冲液中恢复部分构象和活性
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底物降解：复性后的MMP在37℃孵育期间降解周围包埋的明胶
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染色显影：考马斯亮蓝染色后，明胶降解区域呈现深蓝色背景上的透明/白色条带
该技术灵敏度高，可同时检测酶原和活性形式，并能区分MMP-2和MMP-9。
01 / 主要试剂配制
凝胶相关试剂
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明胶储存液：1%明胶（用超纯水配制），4℃保存，一周内使用
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8%分离胶（含0.1%明胶）
30%丙烯酰胺 2.7 mL
超纯水 4.5 mL
1.5 M Tris-HCl（pH 8.8） 2.5 mL
10% SDS 100 μL
10%过硫酸铵（APS） 100 μL
TEMED 6 μL
明胶储存液：按终浓度0.1%加入
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浓缩胶（5%）
超纯水 2.1 mL
30%丙烯酰胺 0.5 mL
1.0 M Tris-HCl（pH 6.8） 0.38 mL
10% SDS 30 μL
10% APS 30 μL
TEMED 3 μL
电泳缓冲液
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5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液（pH 8.3）
0.125 M Tris-HCl
1.25 M甘氨酸
0.5% SDS
样品缓冲液
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5×非还原上样缓冲液
1 M Tris-HCl（pH 6.8） 30%
甘油 25%
10% SDS 10%
0.05%溴酚蓝
注意：不可添加β-巯基乙醇或DTT
洗涤与孵育缓冲液
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洗脱液（去除SDS）
2.5% Triton X-100
50 mM Tris-HCl（pH 7.6）
5 mM CaCl₂
1 μM ZnCl₂
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漂洗液
50 mM Tris-HCl（pH 7.6）
5 mM CaCl₂
1 μM ZnCl₂
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孵育液（酶反应缓冲液）
50 mM Tris-HCl（pH 7.5-7.6）
150 mM NaCl
10 mM CaCl₂
1 μM ZnCl₂
0.02% Brij-35（或1% Triton X-100）
可选添加：5 mM邻二氮菲（蛋白酶抑制剂，抑制其他蛋白酶）
染色与脱色液
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染色液
0.25%考马斯亮蓝R-250
45%甲醇
10%乙酸
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脱色液
30%甲醇
10%乙酸
02 / 实验步骤详解
实验流程
样品制备
洗涤、漂洗
蛋白复性
SDS-PAGE
孵育
酶促反应
染色
脱色
2.1
样品制备
条件培养基制备
将细胞接种于六孔板（2 mL/孔）或75 cm²培养瓶（10 mL），使用含FBS的完全培养基培养
细胞达70%-80%汇合度时，去除含FBS培养基
用无血清培养基洗涤细胞2次
更换为无血清培养基继续培养（时间需优化：如乳腺癌细胞231G和468需40-44小时）
收集条件培养基，4℃离心（2000×g，10分钟）或过滤去除死细胞和碎片
浓缩样品：使用超滤离心管浓缩10倍（可选步骤）
蛋白浓度测定：调整样品至相同蛋白浓度
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建议测试两个浓度：5 μg/mL和15 μg/mL
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用PBS或Tris缓冲液（pH 7.5）稀释，可加0.5% PMSF
组织样品制备
使用常规蛋白提取方法
关键注意事项：
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提取缓冲液不能含EDTA（螯合Zn²⁺，抑制MMP活性）
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不能含β-巯基乙醇或DTT（破坏二硫键，影响酶复性）
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推荐使用：PBS或50 mM Tris-HCl（pH 7.5），可加0.5% PMSF
2.2
SDS-PAGE电泳
凝胶制备
制备含0.1%明胶的7.5%-8%分离胶
灌胶时注意排除气泡
上层加入5%浓缩胶，插入梳子
样品处理
样品与5×非还原上样缓冲液混合（4:1比例）
关键：样品不要煮沸，室温放置10分钟后直接上样
上样与电泳
上样量：通常10-20 μL，含50 μg总蛋白（可根据预实验调整）
一个泳道加入蛋白质分子量标记
电泳条件：4℃，130-150 V恒压
电泳至溴酚蓝到达凝胶底部（约2.5小时）
2.3
凝胶后处理与显色
洗涤（去除SDS，酶复性）
洗脱液洗涤：室温摇床，2次，每次30-40分钟
漂洗
漂洗液洗涤：室温摇床，2次，每次20分钟
孵育（酶解反应）
加入新鲜孵育液
37℃恒温孵育24-48小时
重要：使用普通培养箱，避免CO₂培养箱（改变pH）
染色
考马斯亮蓝染色液染色：室温摇床，1-3小时
脱色
脱色液脱色：更换数次，直至背景清晰、条带明显
脱色时间根据观察效果调整
成像分析
使用凝胶成像系统拍照
白色条带对应MMP活性区域
可使用ImageJ等软件进行半定量分析
03 / 注意事项与疑难解答
Tips
关键注意事项
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样品处理
避免使用EDTA、EGTA等金属离子螯合剂
避免使用还原剂（β-巯基乙醇、DTT）
样品不可煮沸
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缓冲系统
所有缓冲液用超纯水配制
精确控制Ca²⁺（5-10 mM）和Zn²⁺（1 μM）浓度
孵育液pH严格控制在7.5-7.6
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孵育条件
使用普通37℃培养箱，避免CO₂培养箱
孵育时间需优化（通常24-48小时）
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对照设置
阳性对照：已知活性的MMP样品
阴性对照：不含MMP的样品或添加EDTA的样品
空白对照：仅上样缓冲液
Solution
常见问题与解决方案
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问题现象 |
可能原因 |
解决方案 |
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无条带出现 |
酶活性过低 |
增加样品上样量 |
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样品制备不当 |
检查样品是否含有抑制剂 |
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孵育条件不佳 |
确保孵育缓冲液pH正确 |
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背景过深 |
脱色不充分 |
延长脱色时间，频繁换液 |
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染色时间过长 |
缩短染色时间至30-45分钟 |
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条带弥散 |
酶过度降解 |
缩短孵育时间至18小时 |
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孵育时间过长 |
降低孵育温度至30℃ |
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多条非特异性条带 |
明胶污染 |
使用新鲜配制的明胶溶液 |
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其他蛋白酶干扰 |
添加特异性MMP抑制剂对照 |
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条带位置异常 |
电泳条件不当 |
确保恒压电泳，维持低温 |
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蛋白标记物问题 |
使用新鲜预染蛋白标记物 |
04 / 技术应用
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主要应用领域
肿瘤转移研究：评估MMP-2/MMP-9活性与肿瘤侵袭性的关系
药物筛选：检测MMP抑制剂的效应
疾病机制研究：炎症、心血管疾病等涉及ECM重塑的病理过程
细胞功能分析：不同细胞类型或处理条件下MMP表达与活性的变化
Applications
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方法优势
高灵敏度：可检测ng级的MMP活性
特异性：区分MMP-2和MMP-9的不同分子形式（酶原、活性形式）
半定量：条带强度与酶活性成正比，可进行相对定量
多重检测：同时检测多种MMP的活性
Advantage
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方法局限性
仅检测明胶酶：主要检测MMP-2和MMP-9，不适用于其他MMP
不能绝对定量：结果为相对活性
耗时较长：整个流程需要2-3天
受抑制剂影响：样品中的内源性抑制剂可能影响结果
Limitation
05 / 技术总结
明胶酶谱法是一种经济、灵敏且特异的MMP活性检测技术，能够区分酶原和活性形式，并同时检测多种明胶酶。
成功的关键在于：
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合适的样品制备（避免还原剂和金属螯合剂）
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精确的缓冲液配制（特别是pH和离子浓度）
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严格的孵育条件控制
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合理的对照设置
通过优化实验条件和仔细操作，明胶酶谱法可广泛应用于肿瘤生物学、炎症研究、组织工程等领域的MMP活性检测，为理解细胞外基质重塑机制提供重要工具。
代轩生物 / 蛋白检测服务
代轩生物为您提供专业、全面的蛋白质与核酸相互作用研究一站式技术服务，涵盖从基础定量到高级功能解析的完整流程。我们的服务体系结构清晰，层次分明，旨在为您的研究提供精准可靠的数据支持。
蛋白质基础分析与定量
本层级服务旨在为所有下游实验提供标准化、高质量的样本基础。
BCA蛋白定量：采用经典比色法，精准测定样品总蛋白浓度，确保后续实验上样量一致。
SDS-PAGE考马斯亮蓝染色：快速评估蛋白质样品的纯度、完整性及分子量分布，是样本质控的直观手段。
明胶酶谱检测：特异性检测基质金属蛋白酶（如MMP-2、MMP-9）的活性形式与酶原，服务于细胞外基质降解等研究方向。
蛋白质特异性检测与鉴定
基于抗体抗原反应，对目标蛋白进行定性与半定量分析。
免疫印迹（Western Blot）检测：
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总蛋白检测：分析特定目标蛋白的表达水平。
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磷酸化蛋白检测：揭示信号通路的激活状态，需使用修饰特异性抗体。
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核蛋白/膜蛋白检测：通过亚细胞组分分离技术，富集并检测位于细胞核或细胞膜的特异性蛋白。
蛋白质相互作用研究
在接近生理状态的条件下，深入探索蛋白质之间的功能关联。
免疫沉淀（IP）：从复杂裂解液中特异性富集目标蛋白。
免疫共沉淀（Co-IP）：在非变性条件下，捕获与目标蛋白在体内相互作用的伴侣蛋白，验证蛋白质复合物的存在。
染色质免疫共沉淀（ChIP）：在DNA水平上，研究体内蛋白质（如转录因子、组蛋白）与特定基因组序列的结合情况。
核酸-蛋白质相互作用研究
在体外和体内两个层面，验证生物大分子的直接结合作用。
凝胶迁移（EMSA）：体外验证纯化或富集的蛋白质与标记的DNA/RNA探针是否发生特异性结合。
染色质免疫共沉淀（ChIP）：体内分析蛋白质与基因组DNA的结合位点（此技术亦属第三层级）。
我们的技术团队将根据您的具体科学问题，协助选择并优化实验方案，从实验设计、严谨执行到专业数据分析，为您的研究全程护航，提供可信赖的实验结果与报告。
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