WB、IF、FC、ELISA、IP、IHC怎么选？一文讲透六大蛋白检测技术

原理：基于分子量的分离与鉴定。将蛋白质混合物按分子量大小进行电泳分离后，转膜固定，再利用抗体进行特异性识别检测。

作用：

• 定性验证：确认目标蛋白的存在。

• 半定量分析：比较不同样品间同一蛋白的表达量差异（需以内参蛋白校正）。

• 特性鉴定：检测蛋白质的分子量大小、剪切体或特定的翻译后修饰（如磷酸化、糖基化，需使用修饰特异性抗体）。

典型实验目的应用：

• 验证基因敲除/敲低或过表达后目标蛋白水平的变化。

• 检测信号通路中关键蛋白的活化状态（如磷酸化水平）。

• 分析药物处理后特定蛋白的表达调控。

检测样本类型：细胞或组织的全蛋白/亚细胞组分裂解液。样本已被彻底破坏，失去空间信息。

原理：细胞或组织原位可视化。在保持细胞或组织结构完整性的前提下，使抗体穿透进入，与目标蛋白结合，通过荧光（IF）或显色（IHC）信号在原位显示蛋白的精确位置。

作用：

• 亚细胞定位：明确蛋白分布于细胞核、细胞质、细胞膜或特定细胞器。

• 组织学分布：观察蛋白在特定组织区域（如肿瘤核心区、血管周围）或特定细胞类型中的表达。

• 共定位分析：通过多色标记，研究两个或多个蛋白在空间上的重叠关系，提示其潜在相互作用或共同功能区域。

• 半定量分析：通过分析荧光/显色信号强度，比较不同样本间目标蛋白的表达水平（需结合图像分析软件）。

典型实验目的应用：

• 研究转录因子在刺激后是否发生核转位。

• 观察细胞连接蛋白（如E-cadherin）在细胞膜上的分布及完整性。

• 在病理切片中鉴定特定生物标志物（如Ki67增殖指数、HER2表达）的表达位置与强度。

• 验证细胞类型特异性标记物。

检测样本类型：

• IF：培养的贴壁或悬浮细胞（涂片）、冷冻组织切片。

• IHC：石蜡包埋组织切片（最常用）、冷冻组织切片。IHC更侧重于组织架构下的分析。

原理：高速、多参数的单细胞统计分析。使悬浮的单细胞逐个高速通过激光检测点，同时收集每个细胞的散射光（反映细胞大小和复杂度）和多个荧光通道的信号，从而对成千上万个细胞进行快速、多维度的分析或分选。

作用：

• 细胞表型分析：对混合细胞群体进行亚群鉴定和比例分析（如免疫细胞分型：CD4+ T细胞、CD8+ T细胞等）。

• 蛋白表达定量：精确定量细胞表面或胞内蛋白的表达水平（平均荧光强度，MFI）。

• 功能分析：检测细胞周期、细胞凋亡、细胞增殖、活性氧水平等。

• 细胞分选：通过流式分选仪（FACS）将感兴趣的特定细胞亚群物理性地分离出来，用于后续培养或组学分析。

典型实验目的应用：

• 分析外周血或脾脏中各种免疫细胞的比例变化。

• 分选干细胞或肿瘤干细胞进行功能研究。

• 检测药物诱导的细胞凋亡率。

• 同时检测一个细胞上多个表面标志物的共表达情况。

检测样本类型：制备成单细胞悬液的任何样本，如培养的细胞、血液、淋巴组织、实体瘤解离后的细胞等。

原理：溶液或复杂混合物中目标分子的精确定量。通过将捕获抗体或抗原预先包被在微孔板固相上，特异性“捕捉”样品中的目标物，再通过酶标二抗与底物反应产生信号，其强度与目标物浓度成正比。

作用：

• 绝对定量：通过标准曲线，精确测定样品中目标蛋白或抗原的绝对浓度（如pg/mL）。

• 高通量筛查：可同时对大量样品进行快速检测。

典型实验目的应用：

• 检测细胞培养上清液或血清中的细胞因子、激素、病毒抗原浓度。

• 测定实验动物血清中特定抗体的效价。

• 临床诊断中检测感染标志物（如HBsAg）或肿瘤标志物（如CEA, AFP）。

检测样本类型：液体样本，如血清、血浆、细胞培养上清、组织裂解液（已均质化）、尿液等。

原理：利用抗体从复杂混合物中特异性“钓取”目标蛋白及其结合复合物。

作用：

• 蛋白富集与纯化：从大量裂解液中浓缩低丰度蛋白，便于后续检测。

• 蛋白质相互作用验证：共免疫沉淀是验证体内相互作用的“金标准”之一。

• 翻译后修饰研究：富集特定修饰的蛋白进行质谱分析或Western Blot验证。

衍生技术与应用：

• Co-IP (共免疫沉淀)：用于验证生理条件下，两个或多个已知/疑似蛋白间的直接或间接相互作用。

• ChIP (染色质免疫沉淀)：用于研究蛋白质（如转录因子、组蛋白修饰）与特定DNA序列的结合。

• RIP (RNA免疫沉淀)：用于研究RNA结合蛋白与其靶RNA的相互作用。

典型实验目的应用：

• 寻找并验证目标蛋白的未知互作伙伴（IP结合质谱）。

• 验证信号通路中上下游蛋白是否存在于同一复合物中（如受体与下游激酶）。

• 富集磷酸化蛋白以研究其动态变化。

检测样本类型：细胞或组织的非变性或温和变性裂解液，需保持蛋白质的天然构象或相互作用状态。