原代细胞分离与培养关键技术指南：方法选择、流程优化与难点解析
原代细胞是指直接从机体组织（如人、小鼠、大鼠等组织）经分离处理后，在体外进行首次培养的细胞。从细胞分离到第一次传代之前的培养阶段称为原代培养，此阶段的细胞保留了体内组织的许多关键特性，包括：
高度生理相关性：比连续传代的细胞系更能代表来源组织的功能状态
有限增殖能力：通常只能传代有限次数（一般10代以内）
异质性：可能包含多种细胞类型
01
Step 1
样本获取与处理
● 样本来源
实验室样本：实验动物/植物的器官、组织（如胚胎、肝、肾、脑等）
临床样本：手术切除的人体组织、活检标本
● 分离操作要点
无菌操作：在生物安全柜中进行所有操作
快速处理：取材后尽快处理（理想情况2小时内）
组织修整：
-
尽量去除不需要的附属组织
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用锋利的器械（手术刀、剪刀）减少机械损伤
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用预冷的PBS或专用运输培养基冲洗2-3次
保存运输：置于4℃ PBS或专用培养基中转运
Step 2
组织解离方法选择
根据组织特性选择最适解离方案：
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类型 |
通用组织 |
优点 |
缺点 |
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酶消化法 |
大多数组织，特别是纤维较多的组织 |
细胞得率高，可获单细胞悬液 |
可能损伤细胞，成本较高 |
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机械法 |
软质组织（脾、胚胎肝、脑、软质肿瘤） |
快速、简单、无酶影响 |
细胞损伤大，得率较低 |
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组织块法（原代外植） |
微量组织样本 |
操作简单，保持细胞微环境 |
细胞迁移慢，可能选择性生长 |
● 酶消化法详解
常用酶制剂及选择：
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酶类型 |
适用组织 |
特点 |
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胰蛋白酶 |
上皮组织、胚胎组织 |
作用强，适合快速消化；37℃长期作用可能损伤细胞 |
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胶原酶Ⅰ型 |
上皮、肺、脂肪、肾上腺 |
温和消化结缔组织 |
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胶原酶Ⅱ型 |
肝、骨、甲状腺、心脏 |
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胶原酶Ⅳ型 |
多种组织通用 |
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胶原酶Ⅴ型 |
胰腺、胰岛组织 |
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中性蛋白酶 |
多种组织，常与胶原酶联用 |
减少对细胞表面蛋白的破坏 |
两种胰蛋白酶消化策略：
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温消化（37℃）
适合大组织快速消化
每隔30分钟收集一次细胞，避免长时间暴露
需轻微搅拌，但对敏感细胞（如上皮细胞）可能造成损伤
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冷消化（4℃过夜）
细胞存活率更高
保留更多细胞类型（特别是上皮细胞）
无需特殊设备，但处理量有限
胶原酶消化注意事项：
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消化缓慢但温和，无需机械振荡
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对于纤维丰富的组织（如肿瘤、肾组织）效果良好
-
可能导致成纤维细胞过度生长，需后续纯化步骤
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成本较高，特别对于大组织样本
● 机械解离方法
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切碎溢出法：用锋利的刀片快速切碎，使细胞从切面释放
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筛网挤压法：将组织块通过不锈钢或尼龙筛网挤压
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注射器吸打法：用大孔径针头反复抽吸组织悬液
-
吸管吹打法：用宽口吸管反复吹打组织块
适用场景：组织来源充足、细胞数量要求不高、需要快速获得结果时。
Step 3
细胞悬液处理与培养
● 消化后处理流程
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终止消化：加入含血清的完全培养基（血清中的蛋白可抑制胰蛋白酶）
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过滤：通过70-100μm细胞筛去除未消化完全的组织块
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离心：300-400g离心5分钟，弃上清
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重悬：用完全培养基重悬细胞，计数并评估活力
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接种：以较高密度接种（通常比细胞系密度高20-50%）
● 培养条件优化
培养基选择：
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常用：DMEM、DMEM/F12、RPMI 1640
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根据细胞类型添加特定生长因子
血清使用：
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原代细胞建议使用胎牛血清（FBS）而非小牛血清
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血清浓度可适当提高（10-20%）
首次换液：48-72小时后进行，去除未贴壁细胞和碎片
培养观察：
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早期培养基变黄（橘黄色）为正常现象，反映细胞代谢活跃
-
组织块法需观察细胞从组织块边缘迁移情况
Step 4
原代细胞的鉴定与验证
为确保获得目标细胞，需进行鉴定：
Step 5
原代细胞的维持与保存
● 传代时机
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细胞融合度达80-90%时传代
-
首次传代后细胞状态通常更稳定
● 冻存方案
冻存液配方（任选其一）：
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10% DMSO + 90% FBS
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10% DMSO + 40% FBS + 50% 基础培养基
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5% DMSO + 45% 基础培养基 + 50% FBS
冻存要点：
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使用程序降温盒或控制降温速率（-1℃/分钟）
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保存于液氮中长期储存
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建议在传代1-2次后冻存备份
02
控制消化时间：密切观察组织状态，及时终止消化
低温操作：除消化步骤外，尽量在4℃操作
轻柔处理：避免剧烈吹打和高速离心
快速接种：分离后尽快将细胞接种到培养容器中
严格无菌操作，特别是临床样本
使用含抗生素/抗真菌剂的培养基（仅限初始培养）
定期镜检，早期发现污染迹象
细胞不贴壁：检查培养表面处理、血清质量、接种密度
生长缓慢：优化培养基成分，添加适当生长因子
成纤维细胞过度生长：采用差速贴壁、免疫磁珠分选等方法纯化
早期老化：检查培养条件，避免过度传代
03
原代细胞广泛用于：
基础研究：信号通路、基因表达、蛋白功能研究
药物开发：药物筛选、毒性测试、代谢研究
疾病模型：建立更贴近生理状态的体外模型
组织工程：细胞治疗和再生医学研究
常用检测方法：
增殖检测：CCK-8、MTT、EdU标记
细胞周期：流式细胞术PI染色
凋亡检测：Annexin V/PI双染、TUNEL
迁移侵袭：划痕实验、Transwell
04
尊重细胞特性：不同组织来源的细胞需要差异化的处理方案
平衡效率与活力：在解离效率和细胞保护之间找到最佳平衡点
模拟体内环境：尽可能提供接近生理条件的培养环境
质量控制：建立标准化的鉴定和验证流程
耐心细致：原代细胞培养需要更多的观察和调整
原代细胞培养虽然技术挑战较大，但其提供的生物学相关性和生理准确性是细胞系无法替代的。通过系统掌握分离、培养和鉴定技术，研究人员能够建立高质量的体外模型，为生命科学研究和医学应用提供有力工具。
Tips：原代细胞培养的成功很大程度上依赖于经验积累，建议在初期与有经验的研究者合作，并做好详细的实验记录，包括组织来源、处理时间、酶浓度、消化时间等所有关键参数，这有助于建立适合自己研究体系的标准化流程。
BiotechDX
基于领先的原代细胞分离与培养技术，代轩生物为客户提供从细胞获取到功能解析的一站式解决方案，全面支持药物研发、疾病模型构建及细胞治疗研究。
● 核心技术服务
① 原代细胞定制化分离与培养
多物种、多组织来源：涵盖人、小鼠、大鼠、兔等常用实验动物的多种组织（如肝、肾、心、脑、肺、皮肤、血管、肿瘤组织等）。
标准化分离流程：根据组织特性，优化酶消化法（胶原酶、胰酶等）或组织块法，确保细胞高活性与高纯度。
细胞保种与建系：提供原代细胞冻存保种服务，并可建立特定功能的原代细胞系，满足长期研究需求。
② 细胞功能操控与基因编辑
细胞基因操作：提供高效的质粒、siRNA及CRISPR-Cas9系统转染服务，实现基因过表达、敲低或敲除。
稳转细胞系构建：通过筛选标记（如嘌呤霉素、G418等），构建稳定表达或沉默特定基因的细胞株。
干细胞定向诱导分化：对间充质干细胞等进行成骨、成脂、成软骨等多向诱导分化，提供分化全程监测与鉴定。
③ 细胞增殖与活性检测
活力与毒性检测：采用MTT、CCK-8等方法，精确评估药物、化合物或基因操作对细胞增殖与活性的影响。
克隆形成能力分析：通过平板克隆形成实验，评估细胞群体依赖性与增殖潜能。
活死细胞染色：利用Calcein-AM/PI等荧光染色，直观观察细胞存活状态与分布。
④ 细胞运动与形态功能分析
迁移与侵袭能力检测：通过划痕实验、Transwell及Matrigel侵袭实验，定量分析细胞运动与侵袭能力。
血管生成模拟：进行体外成管实验，评估内皮细胞血管生成潜能。
细胞骨架与形态分析：提供细胞骨架染色（如鬼笔环肽）、细胞形态追踪等服务。
⑤ 细胞分化与功能鉴定
干细胞鉴定：通过表面标志物检测（流式细胞术）、多能性基因表达及分化潜能验证，全面鉴定干细胞特性。
成骨分化评价：采用ALP染色、茜素红染色及成骨相关基因检测，定量评估成骨分化进程。
免疫细胞分型与功能分析：
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巨噬细胞M1/M2分型鉴定
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Treg细胞检测
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Th1/Th2/Th17细胞亚群分析
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细胞因子分泌谱检测
⑥ 细胞信号与代谢检测
氧化应激与代谢状态：
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活性氧（ROS）水平检测
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线粒体膜电位（JC-1）检测
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细胞内钙离子浓度动态监测
细胞周期与凋亡分析：
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PI/RNase法检测细胞周期分布
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Annexin V-FITC/PI双染法定量早期与晚期凋亡
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Caspase活性检测等
⑦ 分子互作与信号通路研究
双荧光素酶报告基因检测：用于启动子活性分析、信号通路验证及miRNA靶点确认。
细胞内蛋白定位与互作：提供细胞表面、胞内及核内抗原的荧光标记与共定位分析。
磷酸化与信号节点检测：通过流式细胞术或Western Blot，检测关键信号蛋白的磷酸化状态。
⑧ 细胞分选与纯化
流式细胞分选：基于特定表面标志物，分选高纯度细胞亚群（纯度通常>95%）。
免疫磁珠分选：提供阳性或阴性分选方案，快速获得目标细胞。
● 质量保证
严格质控：所有细胞均进行无菌、支原体检测及活力鉴定。
标准操作：实验流程遵循SOP，确保结果可重复。
项目跟踪：专人负责，全程进度透明可查。
数据可靠：提供原始图像、流式文件及统计分析，支持结果复核。
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