酶联免疫吸附测定（ELISA）：原理、操作与应用指南

抗原直接吸附于板→酶标一抗→底物显色

优点：步骤少、时间短、交叉反应风险低

不足：信号可能较弱、每种抗体需单独标记

应用：检测高丰度、大分子抗原

抗原吸附于板→未标记一抗→酶标二抗（抗一抗）→底物显色

优点：信号放大（二抗多标记）、灵活性高（一抗无需标记）

不足：步骤稍多、潜在交叉反应（二抗）

应用：血清学检测（如病原体抗体筛查）

捕获抗体包被板→捕获抗原→检测抗体（常酶标）→底物显色（检测抗体也可不标记，再加酶标三抗）

优点：灵敏度高、特异性强（需两个表位）、适合复杂样品

不足：抗原需足够大（≥两个表位）、需配对抗体

应用：细胞因子、激素、病毒抗原定量检测

1. 板包被抗原A→加入样本抗原（未知量）和定量酶标抗体→竞争结合→结合酶标抗体量与样本抗原量负相关

2. 板包被抗体→加入样本抗原和定量酶标抗原→竞争结合→结合酶标抗原量与样本抗原量负相关

优点：适合小分子（半抗原）、样品基质耐受性较好

不足：信号与浓度关系为负相关、优化可能复杂

应用：药物、激素、小分子污染物检测

用碳酸盐包被缓冲液（pH9.6）稀释纯化的目标抗原至合适浓度。

加入微孔板各孔（通常100μL/孔）。

4°C过夜或37°C孵育1-2小时，使抗原吸附于孔底塑料表面。

弃去孔内溶液。

加入封闭缓冲液（常用含1-5% BSA或5% 脱脂奶粉的PBS或TBS）至各孔（200-300μL/孔）。

37°C孵育1-2小时或室温孵育2小时。

目的：封闭孔板表面未被抗原占据的位点，减少后续步骤中抗体或蛋白的非特异性吸附，降低背景。

弃去封闭液。无需干燥。

在后续每步孵育后及显色前均需充分洗涤，以去除未结合物质。

向孔内加入洗涤缓冲液（常用含0.05%  Tween-20的PBS，PBST），浸泡约30秒后弃去。重复此过程3-5次。最后一次洗涤后在吸水纸上拍干孔板。

用抗体稀释液（常为含0.05-0.1% Tween-20和1% BSA的PBS）稀释待测样本（如血清）和/或标准品/对照品（阳性、阴性对照）。

加入稀释好的样品/对照品至对应孔中（通常100μL/孔）。

37°C孵育1-2小时或室温孵育2小时或4°C过夜（需优化）。

弃去孔内液体，充分洗涤。

用抗体稀释液稀释针对一抗种属的酶标二抗（常用HRP或AP标记）。

加入稀释好的酶标二抗至各孔（100μL/孔）。

室温避光孵育1小时或37°C孵育30-60分钟。

弃去孔内液体，充分洗涤，通常增加次数至5-6次）。

根据标记酶选择相应底物溶液：

- HRP（辣根过氧化物酶）：常用TMB （3,3',5,5'-四甲基联苯胺，显蓝色）或OPD （邻苯二胺，显橙黄色），需提供H₂O₂。

- AP（碱性磷酸酶）：常用pNPP（对硝基苯磷酸盐，显黄色）。

加入新鲜配制的底物溶液至各孔（100μL/孔）。

室温避光孵育一段时间（通常5-30分钟，需预实验确定最佳显色时间，避免过强或过弱）。

当阳性对照孔显色达到预期深度或标准曲线最高点显色合适时，加入终止液（如HRP用 TMB时加2M H₂SO₄；AP用pNPP时加NaOH 或EDTA）终止酶反应（50-100μL/孔）。

颜色发生变化（TMB由蓝变黄，pNPP黄色加深）。

立即在酶标仪上读取各孔在特定波长下的吸光度（OD值），如TMB终止后通常在450nm读取（参比波长630nm），pNPP在405nm读取。

定性：比较样品孔OD值与设定的Cut-off值（常为阴性对照均值+2或3倍标准差）判断阴阳性。

定量：以标准品浓度为横坐标（X轴），对应OD值为纵坐标（Y轴），绘制标准曲线（常用四参数或对数拟合）。根据样品OD值在标准曲线上插值计算浓度。

问题现象 1——高背景（所有孔都深）

问题现象 2——信号弱/无信号

问题现象 3——孔间重复性差（CV大）

问题现象 4——标准曲线线性差/拟合差

问题现象 5——假阳性

问题现象 6——假阴性