活性氧（ROS）检测：解密细胞氧化应激的关键
活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）是一类含氧化学活性分子的统称，包括自由基（如·O₂⁻、·OH）和非自由基（如H₂O₂、¹O₂）。它们是细胞有氧代谢的天然副产物，也是调控生命活动的关键信号分子。
一、为什么检测活性氧（ROS）？
活性氧（ROS）是细胞氧化还原状态的关键指标，其动态平衡直接影响凋亡、免疫、衰老等生物学过程。
氧化应激评估：高浓度ROS会损伤DNA、蛋白质和脂质，导致细胞凋亡或坏死。
疾病机制研究：ROS参与癌症、神经退行性疾病（如阿尔茨海默病）、心血管疾病及糖尿病的发展。
药物毒性筛选：药物或化学物质可能诱发ROS过量，导致细胞毒性。
免疫反应研究：免疫细胞（如中性粒细胞）通过“呼吸爆发”产生活性氧杀灭病原体。
细胞信号传导：生理浓度的ROS是第二信使，调控增殖、分化、自噬等通路（如MAPK/NF-κB通路）。
注意：需区分生理性ROS（信号作用）和病理性ROS（氧化损伤）！
二、实验操作步骤（流式细胞术）
图2. 荧光探针DCFH-DA检测ROS原理
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标准化流程 |
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步骤 |
操作细节 |
时长 |
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细胞准备 |
收集对数生长期细胞，PBS洗2次，调整密度至1×10⁶ cells/mL |
15 min |
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探针负载 |
无血清培养基稀释DCFH-DA至10 μM，与细胞悬液等体积混合 |
- |
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避光孵育 |
37℃避光孵育（贴壁细胞30 min，悬浮细胞20 min）→ 全程锡箔纸包裹 |
20-30 min |
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洗涤 |
预冷PBS洗涤3次（300×g, 5 min），彻底去除胞外探针 |
15 min |
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重悬 |
重悬于500 μL含0.5% BSA的PBS（防细胞粘连） |
5 min |
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流式检测 |
上机前加PI（5 μg/mL），488 nm激发（可选做）： FL1通道：检测DCF绿光（ROS） FL3通道：检测PI红光（排除死细胞） |
即时 |
必需对照组
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对照组 |
处理方式 |
目的 |
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空白对照
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未染色细胞 |
设门扣除背景荧光 |
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阴性对照
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仅加DCFH-DA |
确定基础ROS水平 |
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阳性对照
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DCFH-DA + 100 μM H₂O₂（37℃, 15 min） |
验证体系灵敏度 |
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抑制剂对照
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10 mM NAC预处理1h + DCFH-DA |
确认ROS信号特异性 |
三、注意事项
01. 避光操作
探针见光10分钟失效 → 从稀释到检测全程避光（红色灯光下操作更佳）
02. 控制细胞状态
细胞存活率＞90%（死细胞吸附探针致假阳性）
传代次数≤15，汇合度70-80%
03. 探针优化
浓度：5-20 μM预实验筛选（Hela细胞常用10 μM）
孵育时间：超过45分钟易自发氧化
04. 彻底洗涤
残留胞外探针是高背景主因 → 首次洗涤离心后弃上清需换新枪头
05. 低温抑制代谢
洗涤及重悬用4℃ PBS，上机前样本置于碎冰中保存 → 减缓ROS代谢变化
06. 金属离子干扰
避免使用含Fe²⁺/Fe³⁺/Cu²⁺的缓冲液 → 推荐EDTA-PBS（1 mM EDTA）
07. 数据分析要点
圈门策略：FSC/SSC排除碎片 → PI⁻圈活细胞 → FL1分析DCF荧光
定量指标：Fold Change = 处理组MFI / 阴性组MFI（＞1.5有意义）
08. 探针替代方案
需特异性检测线粒体ROS时 → 换用MitoSOX Red（检测O₂⁻）
四、问题及解决方案
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问题现象 |
可能原因 |
解决方案 |
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阴性组荧光偏高 |
探针自发氧化/洗涤不净 |
现配探针+增加洗涤次数 |
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阳性组无响应 |
H₂O₂失效 |
新鲜配制100 mM母液（分装-20℃） |
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数据重复性差 |
孵育时间不一致 |
统一使用计时器分批处理 |
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流式图像拖尾 |
细胞团块堵塞 |
上机前用40 μm滤网过滤 |
当DCFH-DA结果存疑时，同步使用DHE探针（检测O₂⁻）交叉验证，可提高结论可靠性！
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多维度检测平台
✔ 流式细胞术（DCFH-DA/DHE/MitoSOX多探针可选）
✔ 化学发光法（超敏检测低丰度ROS）
✔ 活细胞动态成像（时空分辨率定位）
特色技术保障
死细胞零干扰：专利性死活标记方案
线粒体特异性检测：MitoTracker共定位技术
数据三重验证：流式+荧光显微+ESR交叉质控
全流程服务优势
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环节 |
代轩保障措施 |
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样本前处理
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标准化应激控制（低氧离心/低温运输） |
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实验设计
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定制化方案（药物剂量/时间梯度优化） |
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数据分析
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智能算法扣除自发荧光背景 |
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报告交付
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MFI/Fold Change/直方图叠加三重呈现 |
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