细胞划痕
划痕实验示例图 / 代轩生物
- Sample 40X 丨 24h
目的
在单层贴壁细胞上人为制造一个无细胞的“划痕”区域，模拟伤口，观察细胞向划痕区域迁移、铺满的过程，评估细胞的集体迁移能力（侧向运动能力）。
原理
利用物理方法（如枪头）在融合度接近100%的单层细胞上制造一道划痕，形成无细胞区。细胞会从划痕边缘向中心迁移，通过定时拍照观察划痕宽度随时间的变化，量化细胞迁移的速度和能力。
步骤
✔ 细胞铺板
将细胞消化计数，以较高密度均匀接种于培养皿（6孔板、12孔板最常用）或专用培养皿中。目标是培养过夜后细胞能达到接近100%融合，形成致密单层。铺板均匀性至关重要！
✔ 制造划痕
- 细胞融合度达标后，吸去旧培养基。
- 用无菌PBS轻柔洗涤细胞1-2次，去除漂浮死细胞和血清（血清会促进迁移，干扰基线）。
- 吸尽PBS。
- 关键步骤：使用无菌的、直头的、200μL黄色枪头（或其他尺寸，需保持一致性），垂直于培养皿底部，像用尺子一样，用力均匀、快速、一次性地在细胞层上划出直线。通常划一个“十”字或平行线。避免划破培养皿底部！
- （可选）也可用无菌细胞刮刀，但枪头更常用易得。
✔ 洗涤
用无菌PBS轻柔洗涤2-3次，洗掉划痕产生的脱落细胞碎片。
✔ 加入处理培养基
加入含或不含处理因素（如药物、无血清/低血清）的新鲜培养基（通常含1-2% FBS维持细胞基本活性，过高血清会导致增殖增加干扰迁移）。记录此时为0小时。
✔ 初始拍照
立即将培养皿放在显微镜载物台上（最好有37℃和CO2环境控制），在划痕区域选择几个固定位置（如划痕交叉点、划痕中间），用低倍镜（4x或10x）拍摄清晰的划痕照片。精确标记拍照位置以便后续在同一位置拍照。
✔ 孵育与定时拍照
将培养皿放回培养箱。在预定时间点（如0, 6, 12, 24, 48小时），取出培养皿，快速在显微镜下找到标记位置，拍照记录划痕状态。尽量减少培养皿在培养箱外的时间。
✔ 图像分析与量化
- 使用ImageJ等软件打开不同时间点的照片。
- 测量划痕的宽度（或面积）。通常测量同一位置多条垂直线上划痕两侧细胞边缘的距离。
- 计算划痕愈合率：愈合率(%) = (0小时宽度 - T小时宽度) / 0小时宽度
- 计算迁移速度：速度 = (0小时宽度 - T小时宽度) / 2T (单位如 μm/h，假设细胞从两侧向中心迁移)。
- 绘制愈合率随时间变化的曲线。
注意事项
细胞融合度：必须达到接近100%融合。融合度不足，划痕不清晰；细胞过度生长，划痕后易卷曲脱落。
铺板均匀性：不均匀会导致划痕不同位置宽度不一致，影响测量准确性。
划痕制造：
- 使用同一种规格、新的枪头以保证划痕宽度一致。
- 垂直、用力均匀、快速、一次性划出。划痕要直，边缘清晰。
- 避免划破培养皿底。
洗涤：必须彻底洗去脱落细胞碎片，否则干扰观察和拍照。
血清浓度：处理培养基中血清浓度要一致且合适（通常1-2%）。无血清可能导致细胞死亡而非迁移；高血清则增殖增加干扰迁移。明确实验目的！如研究生长因子作用，需用无血清基础培养基。
位置标记：精确标记拍照位置并确保能找回是实验成功的关键。使用培养皿上的标记或显微镜载物台坐标。
环境控制：显微镜最好配备温控和CO2模块，或在拍照间建立临时CO2环境（如小盒子充CO2）。长时间在箱外拍照会导致pH和温度变化影响细胞。
拍照速度：动作要快，减少细胞在非培养环境中的暴露时间。
细胞增殖干扰：实验时间过长时，细胞增殖会部分“填补”划痕。为区分迁移和增殖效应，可在划痕前用丝裂霉素C或低剂量射线处理细胞抑制增殖（但需验证不影响迁移），或在分析时通过对照实验评估增殖贡献。
图像分析：选择多个视野测量取平均，避免局部差异影响结果。确保不同时间点和不同组间测量方法一致。
