细胞迁移/侵袭
Transwell示例图 / 代轩生物
目的
迁移 (Migration)：检测细胞在趋化因子诱导下穿过微孔膜（不含基质胶）的定向运动能力（趋化性）。
侵袭 (Invasion)：检测细胞穿过覆盖有基质胶(Matrigel)的微孔膜的能力，模拟细胞穿越基底膜的过程（需要分泌蛋白酶降解基质）。
原理
- 利用Boyden chamber原理，将Transwell小室（上室）放入培养板（下室）中。
- 上下室之间由一层带有微孔（通常8μm孔径）的聚碳酸酯膜分隔。
- 迁移：下室加入含趋化因子（如血清、特定生长因子）的培养基，上室加入无血清或低血清培养基的细胞悬液。细胞受下室趋化因子吸引，穿过微孔迁移到膜的下表面。
- 侵袭：在膜的上表面预先铺上一层基质胶(Matrigel)，模拟体内基底膜屏障。细胞需要分泌蛋白酶降解基质胶才能穿过微孔迁移到下表面。
- 固定染色后，对迁移/侵袭到下表面的细胞进行计数。
步骤丨以24孔板Transwell为例
✔ 准备工作
平衡：将Transwell小室和培养板在37℃孵育至少30分钟。
铺胶 (仅侵袭实验)：用预冷的无血清培养基或无血清培养基稀释Matrigel（预实验确定最佳浓度，通常1:8 - 1:10）。将稀释的Matrigel小心加入Transwell小室的上室（膜的上方），每孔约50-100μL（覆盖膜即可，避免形成气泡）。关键步骤！放入37℃培养箱孵育1-4小时使其聚合凝固成胶。
✔ 水化(仅侵袭实验)
吸走上室多余液体，加入无血清培养基（100-200μL）在37℃孵育30分钟水化胶层。吸走水化液。
✔ 制备细胞悬液
消化对数生长期细胞，PBS洗1-2次，用无血清培养基（或含低浓度血清/无趋化因子的培养基）重悬计数，调整至所需密度（需预实验优化，避免过密或过疏）。
✔ 加细胞
小心将细胞悬液加入Transwell小室的上室（迁移实验直接加在膜上，侵袭实验加在凝固的Matrigel上）。每孔细胞悬液体积通常为100-200μL（不超过小室高度）。避免产生气泡！
✔ 加趋化液
在下室（24孔板孔内）加入含趋化因子（通常5-20% FBS或特定浓度因子）的培养基（通常500-600μL）。确保下室液面不接触上室底部膜（否则形成液桥，趋化作用消失）。
✔ 孵育
将组装好的Transwell培养板放入37℃，5% CO2培养箱中孵育一定时间（根据细胞迁移能力，通常6-48小时，需预实验确定）。
✔ 终止与固定
小心取出Transwell小室，用棉签或湿润的无纺布纸轻柔擦去上室膜上表面未迁移/侵袭的细胞。
✔ 固定与染色
固定：将小室放入装有4%多聚甲醛（PFA）或甲醇的孔中固定10-30分钟。
洗涤：用PBS轻轻漂洗。
染色：常用0.1%结晶紫溶液（溶于PBS或水）染色15-30分钟。或用DAPI、Giemsa等染色。
洗涤：用PBS或水轻轻漂洗数次，去除多余染料。晾干。
✔ 细胞计数
- 将小室膜小心剪下（或直接观察），倒扣在载玻片上。
- 在显微镜（100x或200x）下随机选取多个视野（至少5个），计数膜下表面（迁移/侵袭面）的细胞数。
- 计算每个视野的平均细胞数，或拍摄照片后用ImageJ等软件计数。
注意事项
无菌操作：全程无菌操作。
细胞状态与密度：使用状态良好、处于对数生长期的细胞。细胞密度过高会抑制迁移，过低则计数困难。必须预实验优化细胞接种密度和孵育时间！
无气泡：加细胞悬液和Matrigel时绝对避免气泡，气泡处细胞无法迁移。
Matrigel处理 (侵袭实验)：
- Matrigel需在冰上操作（4℃时液态，室温或37℃凝固）。
- 稀释比例和铺胶厚度至关重要，直接影响侵袭难度。必须预实验优化！
- 铺胶要均匀，避免边缘厚中间薄。
- 水化步骤不能省略，否则细胞不易附着。
趋化因子：下室培养基中的趋化因子浓度是实验关键。血清浓度（FBS）是最常用的非特异性趋化源。使用特异性因子需明确其有效浓度。
液面差：务必确保下室液面不接触上室膜底部，维持化学梯度。
擦除上室细胞：这是关键且易出错步骤。必须轻柔、彻底擦净上室膜上表面未迁移的细胞。用力过猛会破坏膜或擦掉已迁移的细胞；擦不干净则背景高。用棉签或专用擦拭工具，PBS湿润后拧干。显微镜检查确认是否擦干净。
孵育时间：时间过长细胞可能增殖或死亡，时间过短迁移细胞太少。严格根据预实验结果确定。
平行重复：每组至少设3个复孔。
迁移 vs 侵袭：侵袭实验就是在迁移实验的膜上加了Matrigel层。比较两者结果可评估细胞降解基质的能力。
膜的选择：孔径（常用8μm）和材质需根据细胞大小选择。聚碳酸酯膜透明易观察。
