细胞周期检测
细胞增殖是一个受精密调控的过程，其核心是细胞周期——细胞从一次分裂结束到下一次分裂完成所经历的完整循环。该周期被划分为四个主要阶段：G0/G1期（细胞生长与准备）、S期（DNA合成）、G2期（分裂前检查与准备）和M期（有丝分裂）。这些阶段的进程与细胞内DNA含量的规律性变化紧密相关：细胞在G0/G1期拥有二倍体（2N） 的DNA含量；进入S期后，DNA开始复制，其含量从2N动态增加至4N；最终在G2/M期达到四倍体（4N） 的DNA含量，直至细胞分裂完成，子代细胞恢复2N含量。
流式细胞术正是利用这一关键的DNA含量变化特征来定量分析细胞周期分布的核心技术。其原理在于使用能特异性嵌入DNA双链的荧光染料（如碘化丙啶PI或DAPI），这些染料与DNA的结合量严格与DNA含量成正比，因此其发出的荧光强度直接反映了细胞内DNA的多少。流式细胞仪通过高速检测大量单个细胞的DNA荧光信号，生成反映群体DNA含量分布的直方图，进而通过数学模型拟合，精确统计出处于G0/G1期、S期和G2/M期细胞的相对比例，为研究细胞增殖状态、药物作用机制以及细胞周期调控等提供关键数据。
常用DNA染料 ▼
实验流程 ▼
- 细胞准备：获取状态良好、活性高的单细胞悬液。
- 处理：根据实验设计进行药物处理、刺激等。
- 收集：胰酶消化（贴壁细胞）或直接收集（悬浮细胞）。
关键点：轻柔操作，避免产生过多细胞碎片。
- 洗涤：用 PBS 或其他缓冲液洗涤细胞 1-2 次，去除培养基和血清干扰。
- (可选) 固定：如需使用 PI 或 DAPI，通常用预冷的 70% 乙醇固定（-20°C 保存数小时至数周）。
关键点：逐滴加入乙醇并持续轻柔涡旋混匀，防止细胞聚集成团。
- RNase 处理 (PI/DAPI 必需)：固定后或染色前，用含 RNase A 的缓冲液孵育（通常 37°C, 15-30 分钟），彻底降解 RNA。
- 染色：加入含 DNA 染料的溶液（如 PI + RNAse 溶液）。避光孵育（通常室温或 37°C, 15-30 分钟）。
关键点：Hoechst 或 Vybrant 染料用于活细胞时，需优化浓度和时间（通常在 37°C 孵育）。
- 过滤：上机前必须使用细胞滤网（如 40 μm 尼龙网）过滤样品！ 这是获得单细胞数据的关键。
- 上机检测：使用流式细胞仪采集数据。
实验结果示例 ▼
关键注意事项与问题解决 ▼
细胞数量不足
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(Events 太少)
原因：洗涤步骤离心损失；重悬过于剧烈损伤细胞；起始细胞数不足。
解决方案：
起始细胞数：进行细胞计数，确保最终染色后每管有至少 2 x 106 个细胞。
洗涤技巧：
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离心后，用 200 μL 精细吸头 (黄色枪头) 小心吸弃上清。
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不要吸得太干净！保留约 10-20 μL 液体在管底，避免吸走细胞团块。
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轻柔重悬细胞沉淀，避免剧烈吹打产生气泡和碎片。
离心参数：使用合适的离心力（通常 300-400g）和时间（5-10分钟），避免过度离心导致细胞压紧难以重悬或损伤。
细胞聚集/粘连体
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(Doublets/Aggregates)
原因：PI 粘附性强；固定时乙醇加入过快导致蛋白变性聚集；样品本身有聚集。
解决方案：
固定关键：将预冷乙醇逐滴加入持续涡旋的细胞悬液中（或反过来将细胞悬液逐滴加入乙醇中）。
过滤：上机前必须过滤！
数据分析：必须去除粘连体！使用 FSC-A/FSC-H 或 PI 的 FL2-A/FL2-W (或对应染料的 Area/Width) 参数设门排除粘连体。粘连体会被误认为是 G2/M 期甚至多倍体细胞，导致结果严重偏差。
缓冲液：染色和上样缓冲液中可加入少量 BSA (0.1-1%) 或 EDTA (0.5-1 mM) 有助于减少非特异性聚集。
上样速度：使用较低的样品上样流速，减少流体压力导致的聚集。
峰形不佳
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(CV 值过高)
原因：染色不均；仪器状态不佳；细胞碎片多；上样速度过快。
解决方案：
染色优化：确保 RNase 充分消化 (PI/DAPI)；保证染料浓度和孵育时间合适且一致；避光。
样品质量：减少细胞碎片（轻柔操作，必要时用 PBS 洗涤去除死细胞/碎片）。
仪器校准：定期用标准微球校准仪器，确保光路和液流稳定，CV 值符合要求。
上样速度：采用低速上样，使细胞逐个稳定通过检测点。
数据分析：确保在分析 DNA 含量直方图时，排除碎片和粘连体后，G0/G1 主峰尖锐（CV 值通常应 <8% 为佳，<10% 可接受）。
染料与染色特异性
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PI/DAPI + RNAse：绝对必须！忘记 RNase 会导致荧光信号异常增高（RNA+DNA），无法得到正确周期分布。
活细胞染料(Hoechst, Vybrant)：注意细胞毒性，浓度过高或孵育时间过长会影响细胞活力和周期进程。需严格优化条件。活细胞分析避免了固定可能带来的影响。
提高 S 期分辨率
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双标法：结合使用 BrdU/EdU（标记新合成 DNA）和 DNA 染料（如 PI 或 Vybrant）。
BrdU/EdU 阳性细胞即为 S 期细胞，结合 DNA 含量分析可以更精确地区分早期 S、中期 S、晚期 S 期细胞。
数据分析要点
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线性 vs 对数坐标：DNA 含量直方图必须使用线性坐标轴 (LIN) 显示荧光强度。
脉冲信号：采集数据时，必须勾选并记录荧光信号的面积 (A) 和宽度 (W)（以及高度 H），这是进行粘连体去除 (Doublet Discrimination) 的基础。
设门策略：
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FSC/SSC 或活染料 (如 DAPI 通道的活/死区分) 去除碎片和死细胞。
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FSC-A/FSC-H 或 FL2-A/FL2-W (或对应染料 A/W) 去除粘连体。
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在剩下的单细胞群体上分析 DNA 含量直方图。
拟合模型：使用专业软件（如 FlowJo, ModFit LT, FCS Express 等）的细胞周期拟合模块进行定量分析。不同模型（如 Dean-Jett-Fox, Watson Pragmatic）适用于不同情况，需根据峰形和数据质量选择。
其他注意事项
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对照：设置未处理或正常生长的细胞作为对照，用于设定门和分析参数。
重复：生物学重复和技术重复对于结果的可靠性至关重要。
安全：PI 是诱变剂，DAPI/Hoechst 也是核酸染料，操作时需戴手套，在指定区域操作，废液按有害化学废液处理。乙醇易燃，注意防火。
仪器配置：确保流式细胞仪的激光器和滤光片配置能激发和检测所选染料（如 PI 常用 488nm 激发，用 610/20nm 或 575/26nm 滤片收集；DAPI/Hoechst 需要紫外或近紫外激光激发）。
总结 ▼
流式细胞周期分析是一个相对成熟但细节决定成败的技术。
成功的关键在于
高质量的样品制备：单细胞悬液、足够细胞数、轻柔操作减少碎片和损失。
精确的染色步骤：RNase 消化、染料浓度、孵育条件、避免聚集。
严谨的上机操作：低速上样、必须过滤、仪器状态良好。
正确的数据分析：去除碎片和粘连体、使用线性坐标、脉冲信号去粘连、专业软件拟合。
