肝缺血再灌注损伤（HIRI）小鼠模型
模型构建方法
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- 肝缺血再灌注损伤（
肝脏缺血再灌注损伤（HIRI）是指缺血器官/组织恢复血流后，非但功能未能恢复，反而出现更严重的代谢功能障碍与结构损伤的现象。本模型通过暂时性阻断小鼠肝中叶与左叶的供血血管（门静脉与肝动脉），造成约70%肝脏缺血，随后恢复血流，模拟临床肝手术、休克或移植中的HIRI病理过程。
缺血期：肝细胞ATP迅速耗竭，导致乳酸、酮体堆积及线粒体功能障碍，引发代谢性酸中毒。缺氧致ATP下降诱发钙离子内流，损伤线粒体。
再灌注期：氧自由基爆发、中性粒细胞浸润、Kupffer细胞活化、细胞凋亡及多种细胞因子（如TNF-α, IL-6等）释放，共同导致肝细胞膜损伤、内皮细胞损伤及微循环障碍，最终造成肝功能衰竭与结构破坏。
实验动物：SPF级C57小鼠，雄性，4-6周龄，体重20-22g。
实验器材：手术剪刀，手术镊子，止血钳，4-0缝线，动脉血管夹，棉签，加热垫
实验分组：
基础必需组：正常对照组（Sham）、模型组（HIRI）
可扩展组别（按需设计）：
- 阳性药对照组（如N-乙酰半胱氨酸）
- 受试药物剂量组（低/中/高）
- 机制研究组（如抑制剂/激动剂干预）
- 时间梯度组（特定时间点深化）
观察时间点：再灌注后 0h, 3h, 6h, 12h, 24h。
Tips：实验材料及方案需基于研究目的进行系统性规划。
03丨模型构建方法
术前准备
小鼠术前禁食12小时，自由饮水。
麻醉与备皮
异氟烷吸入麻醉（也可以采用戊巴比妥钠腹腔麻醉，但异氟烷吸入麻醉更安全）。麻醉成功后，仰卧位固定四肢，腹部术区剃毛，碘酒及75%乙醇消毒。
开腹与血管分离
作腹正中切口（约1cm），打开腹腔。
轻柔分离肝左叶与中叶的肝蒂结构（包含供血的门静脉与肝动脉分支）。
Tips：建议使用棉签进行钝性分离，避免器械损伤肝脏。
诱导缺血
用无创血管夹夹闭肝左叶与中叶的肝蒂（门静脉与肝动脉），造成约70%肝脏缺血（避免严重肠系膜淤血）。
夹闭后约0.5分钟，观察缺血肝叶（左、中叶）颜色明显变白（与非缺血右叶对比），确认阻断成功。
临时关闭腹腔（用止血钳夹闭皮肤切口）。
将小鼠置于37℃恒温加热垫保温。
再灌注
缺血持续60分钟后，重新打开腹腔。
迅速移除血管夹，恢复缺血肝叶血流。
0.5分钟左右，缺血区肝脏由白色逐渐恢复为鲜红色，标志再灌注成功。
Tips：阻断血流需一次成功，避免反复夹闭/松开（缺血预处理效应会减轻损伤）。
逐层缝合腹壁肌肉与皮肤。
术后护理
小鼠清醒后放回饲养笼，密切观察小鼠状态（活动、呼吸、伤口等）及生存状况，并详细记录。
样本采集
按预定时间点：0h, 3h, 6h, 12h, 24h
麻醉小鼠，摘眼球取血。
取出血液，离心分离血清，-80℃冻存备用。
全自动生化分析仪检测血清中ALT（谷丙转氨酶）、AST（天门冬氨酸氨基转移酶）的水平。
统一取肝左叶组织块（约1.5cm × 1cm × 0.2cm）留作病理标本或分生标本。
- 置于4%多聚甲醛固定（用于病理：HE染色、TUNEL染色）。
- 液氮速冻后-80℃保存（用于分子生物学检测）。
Tips：取材时动作轻柔，避免镊子挤压损伤目标组织。可以根据需求检测WB/qPCR/测序等。
✔ 肝功能损伤
检测各时间点（术后0h、3h、6h、12h、24h）血清 ALT (Alanine Aminotransferase, 谷丙转氨酶) 和 AST (Aspartate Aminotransferase, 天门冬氨酸氨基转移酶) 水平（全自动生化分析仪）。显著升高是肝细胞损伤的关键标志。
✔ 组织病理学损伤
统一取肝左叶组织（约1.5cm × 1cm × 0.2cm）于4%多聚甲醛溶液中固定24h后脱水，包埋，进行石蜡切片后行HE染色，tunel染色。
HE染色：评估肝组织结构和坏死程度。
TUNEL染色：检测肝细胞凋亡情况。
典型病理特征：肝小叶结构破坏，网状支架塌陷，肝细胞坏死、空泡变性，肝索紊乱，肝窦充血肿胀，炎性细胞（主要是中性粒细胞）浸润。坏死区域常起始于中央静脉周围。
对照组：肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列，结构清晰。
肝脏损伤半定量评分标准
0分：无损伤。
1分：轻度（胞质空泡化，局部核固缩）。
2分：中度（血窦扩张，胞质空泡化，细胞边界模糊）。
3分：中-重度（凝固性坏死，显著血窦扩张，红细胞外渗至肝索，嗜酸性变，中性粒细胞着边）。
4分：重度坏死（结构丧失，肝索崩解，出血，大量中性粒细胞浸润）。
✔ 炎症反应
采用 ELISA法 检测各时间点（术后0h、3h、6h、12h、24h）血清中关键炎症因子水平，如 TNF-α, IFN-γ, IL-2, IL-6, ICAM-1 等。肝脏损伤后这些因子表达显著升高。
05丨关键注意事项
血管分离
务必使用棉签进行钝性分离，最大限度减少对肝脏的机械损伤。
术前禁食
必需，减少术中胃肠内容物干扰，利于手术操作。
血管阻断
必须一次成功夹闭目标血管。反复夹闭/松开会产生缺血预处理效应，显著减轻后续持续缺血造成的损伤程度，导致模型失败。
保温
手术全程及术后恢复期维持小鼠体温（37℃加热垫），避免低温影响模型稳定性和动物状态。
取材操作
取肝组织时动作轻柔，避免镊子挤压损伤目标组织，影响后续病理或分子检测结果。
标准化
手术操作（如缺血时间、血管夹位置、缝合）、样本采集（时间点、组织部位大小）和后续检测方法需严格保持一致，确保组内和组间可比性。
